Замораживание, размораживание, и упаковка Клетки для транспорта

Клеточные культуры используются в самых разных исследовательских и диагностических целях. Иногда возникает необходимость в хранении клеточных линий для последующей работы, чтобы сохранить клетки, избежать старения, снизить риск контаминации и минимизировать эффекты генетического дрейфа. Клеточные линии могут быть заморожены для длительного хранения.

В этом видео мы покажем вам, как замораживать клетки, выращенные как в монослое, так и в суспензии, а также как размораживать их для последующего культивирования. Здравствуйте, я Рики из лаборатории доктора Лэна в сети лабораторий молекулярной патологии (Molecular Pathology Laboratories Network) в Восточном Теннесси. Сегодня я продемонстрирую вам, как замораживать клетки для длительного хранения и как размораживать их из жидкого азота.

Для заморозки адгезивных клеток человека сначала необходимо снять их с планшета, как при подготовке к пассированию. Имейте в виду, что для криоконсервации лучше всего использовать клетки, находящиеся в логарифмической фазе роста. После того как клетки открепятся и вы остановите действие трипсина, добавив сыворотку или среду, содержащую сыворотку, перенесите клеточную суспензию в стерильную центрифужную пробирку и добавьте два мл.

Полную среду с сывороткой, содержащую клетки из трех или более чашек одной и той же субкультуры из одного источника, можно объединить в одной пробирке. Центрифугируйте клетки в течение пяти минут при 300–350 Gs при комнатной температуре. После центрифугирования удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в 10 мл при температуре 4 °C.

Добавьте к полной среде равный объем среды для замораживания при температуре 4 °C, тщательно перемешайте клетки, затем поместите пробирку на лед и подсчитайте количество клеток. Используя гемоцитометр, разбавьте суспензию дополнительной порцией среды для замораживания, чтобы получить конечную концентрацию клеток 1 миллион или 10 миллионов клеток на миллилитр для заморозки клеток из почти сливной колбы площадью 25 см². Ресуспендируйте клетки примерно в трех мл среды для замораживания и перенесите по 1 мл аликвот клеточной суспензии в маркированные криопробирки объемом 2 мл.

Обязательно плотно закройте крышки флаконов. Поместите флаконы в морозильник при температуре -80 °C на время от одного часа до ночи, затем перенесите их в хранилище с жидким азотом. Замораживание клеток из суспензионной культуры по своему принципу аналогично замораживанию клеток из монослоя.

Основное различие заключается в том, что суспензионные культуры не требуют предварительной трипсинизации. Перенесите клеточную суспензию в центрифужную пробирку и центрифугируйте в течение 10 минут при 300–350 G при комнатной температуре. Затем удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в замораживающей среде при 4 °C до плотности от 1 миллиона до 10 миллионов клеток на мл.

Затем перенесите аликвоты клеточной суспензии по 1 ml в криопробирки и заморозьте. Как и в случае с монослойными культурами, метод размораживания и восстановления замороженных пробирок которого был продемонстрирован в предыдущей главе: сначала извлеките пробирку с клетками из морозильника с жидким азотом и немедленно поместите ее в водяную баню при 37 °C.

Непрерывно встряхивайте флакон до размораживания среды, что обычно занимает менее 60 секунд. После размораживания, перед открытием, протрите верхнюю часть флакона 70% этанолом. Затем перенесите размороженную клеточную суспензию в стерильную центрифужную пробирку, содержащую 2 мл подогретой полной среды и 20% фетальной бычьей сыворотки, и центрифугируйте.

Центрифугируйте смесь в течение 10 минут при 150–200 Gs при комнатной температуре. Этот этап позволит удалить остатки DMSO. После центрифугирования слейте супернатант и осторожно ресуспендируйте осадок клеток в небольшом объеме (около 1 мл) полной среды с 20% FBS. Перенесите полученную суспензию в соответствующим образом маркированную культуральную пластину, содержащую необходимое количество среды. Как правило, 1 мл клеточной суспензии требуется на 5–20 мл среды.

Теперь можно поместить клетки в инкубатор при 37 °C для культивирования в течение 24 часов. Убедитесь, что клетки прикрепились к планшету; через пять-семь дней или при изменении цвета pH-индикатора в среде необходимо заменить среду. Культуры следует содержать в среде с 20% FBS до полного восстановления клеточной линии.

Если скорость восстановления крайне низка, возможно, растет только часть исходной культуры. Будьте особенно внимательны к этому при работе с клеточными линиями, которые, как известно, являются мозаичными. Если культуры необходимо отправить, это можно легко сделать как для монослойных, так и для суспензионных культур.

В культуральных флаконах объемом 25 сантиметров клетки выращивают до почти полной конфлюэнтности в монослое или до необходимой плотности в суспензии. Для монослойных культур сначала удаляют среду, а затем заполняют флакон свежей средой. Важно, чтобы флакон был полностью заполнен средой, чтобы предотвратить высыхание клеток при переворачивании флаконов во время транспортировки.

Для свежих суспензионных культур в колбу добавляют среду до полного заполнения. Крышку плотно закручивают и фиксируют с помощью парафильма. Колбу помещают в герметичный пластиковый пакет или другой герметичный контейнер, предназначенный для предотвращения утечки содержимого.

На случай возможного повреждения колбы первичный контейнер помещают во вторичный изолирующий контейнер для защиты от экстремальных температур при транспортировке. На внешнюю сторону упаковки наклеивают этикетку о биологической опасности. Как правило, культуры транспортируются курьерскими службами экспресс-доставкой в тот же день или на следующий день.

Мы только что продемонстрировали вам способ заморозки и размораживания культур клеток человека как для адгезивных, так и для суспензионных клеток. На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.