Всего-клеточные Recordings Света Вызванные Возбуждающие Synaptic токи в сетчатке глаза фрагмент

Сегодня я покажу вам, как подготовить срезы сетчатки тигрового саламандра для регистрации методом патч-клампа. Сначала я подготовлю два вида предметных стекол. Мы используем стекла с прикрепленным к ним адгезивным углублением, чтобы использовать их в качестве жидкостных камер.

На первом предметном стекле я наношу две параллельные полоски вакуумной смазки. Затем я беру фильтровальную бумагу и разрезаю её на прямоугольные фрагменты с помощью линейки. Теперь я помещаю один из фрагментов на направляющие из смазки и прижимаю его, чтобы он плотно прилегал к стеклу.

Я повторяю те же действия с другим элементом. На предметных стеклах второго типа приклеены маленькие резиновые блоки. На данном этапе я просто наношу немного вакуумной смазки между блоками, а также устанавливаю новое лезвие бритвы в томограф (слайсер для тканей).

Наконец, я подготовил инструменты, которые понадобятся мне во время диссекции: два пинцета, один нож и инструмент для извлечения глаза из головы с целью регистрации световых вызванных токов. Диссекцию следует проводить при ИК-освещении, однако в целях демонстрации я буду работать при обычном свете. Сначала я извлекаю глаз и помещаю его под микроскоп на листок бумажной салфетки, смоченной ледяным раствором Рингера.

Затем я удаляю излишки соединительной ткани с глазного яблока, чтобы убедиться, что они не повредят глаз. Я всегда делаю разрез вдоль поверхности. Вот что видно через микроскоп.

Затем с помощью лезвия бритвы я делаю небольшой разрез в роговице. Для этого я фиксирую глаз пинцетом, прижимая край лезвия бритвы к роговице. После этого я удерживаю роговицу пинцетом и удаляю ее ножницами, чтобы извлечь хрусталик.

Я слегка надавливаю на края глазной чаши, чтобы обеспечить удобный доступ к хрусталику с помощью пинцета. Затем я удаляю радужку. Удерживая радужку пинцетом, я делаю разрез вдоль aura serato до тех пор, пока не останется только глазная чаша.

Затем я разрезаю I-чашку на два прямоугольных фрагмента. Сначала я разрезаю её пополам, а затем подрезаю верхний и нижний края. Теперь я беру один из ранее подготовленных предметных стекол, поднимаю фрагмент I-чашки и помещаю его стороной сетчатки вниз на фильтровальную бумагу.

Затем я оттягиваю эту склеру так, чтобы на предметном стекле осталась только сетчатка. После этого я быстро добавляю раствор Ringers в камеру. Повторим эту процедуру для второго фрагмента сетчатки.

Но на этот раз вы можете наблюдать через микроскоп в процессе переноса сетчатки на фильтровальную бумагу. С помощью пинцета в левой руке я осторожно придавливаю склеру. В завершение я разрезаю сетчатку на срезы шириной от 200 до 300 мкм.

Затем я выбираю срез для проведения своих экспериментов. Чтобы выбрать подходящий срез, мне необходимо повернуть срезы на 90 градусов, чтобы стали видны слои сетчатки. Я выбираю срез, который выглядит неповрежденным и имеет отчетливые горизонтальные полосы, указывающие на различные слои.

Для перемещения срезов с одного предметного стекла на другое я создаю мостик из раствора Рингера, а затем осторожно перемещаю срезы через этот раствор. При помещении среза я прижимаю его к резиновым блокам таким образом, чтобы фильтровальная бумага была ориентирована вертикально по отношению к стеклу. Теперь я готов к регистрации методом патч-клампа.

Мы храним внутриклеточный раствор небольшими порциями в морозильной камере, чтобы размораживать только то количество, которое потребуется на один день. Перед заполнением электродов мы фильтруем раствор для удаления мелких частиц, которые могут закупорить кончик электрода. Для регистрации сигналов с ганглионарных клеток патч-электроды вытягивают из боросиликатного капиллярного стекла.

Я выбираю настройку вытягивания, которая обеспечит сопротивление электродов от двух до четырех МОм. При заполнении электродов необходимо убедиться в отсутствии пузырьков воздуха в кончике электрода. Чтобы удалить пузырьки, можно слегка постучать пальцем по стеклу.

Это держатель электродов, прикрепленный к головному блоку. В электророллере находится проволока из хлорида серебра. Это заземляющий электрод с мостиком Агар-Агар.

Перед вами перфузионная пипетка. Она подключена к восьмиканальной системе микроперфузии. Основная перфузия осуществляется за счет силы тяжести: раствор из флакона с крыльями стекает по этой трубке в регистрационную камеру.

Для возможности записи в темноте к боковому порту микроскопа подключена ИК-камера, соединенная с ТВ-экраном. К верхнему порту я подключил проектор изображений, который позволяет проецировать визуальные стимулы на сетчатку. И, наконец, усилитель для метода патч-кламп.

Теперь я помещаю срез сетчатки под микроскоп и добавляю заземляющий электрод в ванночку для настройки основной перфузии. Затем ввожу трубку из системы гравитационной перфузии. Стеклянная трубка с другой стороны подключена к вакуумному отсосу, который поддерживает постоянный уровень жидкости.

Я также проверяю, чтобы всасывающая трубка была подключена к электроплечом. Затем я устанавливаю микроперфузионную пипетку. Я опускаю её в ванну вслед за объективом микроскопа.

Приблизившись к срезу, я немного отвожу инструмент, чтобы раствор попал на срез. После включения перфузии срез должен слегка сместиться, как показано здесь. Теперь приступим к поиску подходящей клетки для регистрации.

Мы ищем ганглионарные клетки, которые расположены в нижней части среза. Теперь я подготавливаю электрод: перед погружением в ванночку я создаю некоторое положительное давление. Обнаружив электрод под микроскопом, я опускаю его непосредственно над срезом, чтобы выполнить патч-кламп клетки.

Я переключился на объектив 40 x. Теперь я обнуляю базовый ток и проверяю сопротивление электрода. Тест на герметичность представляет собой последовательность импульсов амплитудой 10 мВ, что позволяет мне убедиться в создании плотного уплотнения между электродом и клеткой.

Теперь я опускаю электрод на целевую клетку. Как только я вижу вмятину на теле клетки, я сбрасываю положительное давление из трубки, чтобы создать плотное уплотнение. Сопротивление становится настолько высоким, что кривая тока выглядит плоской.

Небольшие всплески представляют собой емкостные артефакты электрода. Их можно компенсировать следующим образом, после чего они исчезнут. Теперь я попробую прорвать мембрану клетки.

Для этого я осторожно подаю короткие импульсы всасывания в трубку, подключенную к плечу электрода, и, если всё сделано правильно, кривая тока изменяется следующим образом. Спайки, которые вы сейчас видите, обусловлены емкостью мембраны, и теперь их можно скомпенсировать. Данный препарат был подготовлен в темноте. Давайте посмотрим, удастся ли нам зарегистрировать ответы, вызванные светом.

Кривая, которую вы видите на осциллографе, представляет собой токовый ответ ганглионарной клетки при фиксированном потенциале мембраны минус 60 millivolts. В качестве световых стимулов мы используем светлые и темные полосы, предъявляемые на стабильном однородном фоне. Программное обеспечение нашей лаборатории отображает полную запись одного пробного испытания.

Видно, что это «выключенная» клетка (off-cell), реагирующая на появление темной полосы и исчезновение светлой полосы. Белая линия сверху указывает на продолжительность стимула. Теперь мы можем провести эксперименты, используя перфузию различных фармакологических агентов.

Например, мы можем заблокировать ГАМК-ергическое и глицинергическое торможение. Обычно эффекты препарата начинают проявляться спустя менее одной минуты. Ответ стал более сильным и продолжительным.

Метод подготовки срезов сетчатки широко используется для регистрации синаптических токов различных клеток сетчатки; при добавлении флуоресцентного красителя в раствор электрода можно легко подтвердить тип клетки. В данной работе в качестве животной модели используются личинки саламандры TGA. Тот факт, что саламандры являются холоднокровными животными и обладают крупными клетками сетчатки, обеспечивает благоприятные условия для регистрации, однако этот же метод может быть применен и к препаратам млекопитающих.