Хроматин Иммунопреципитация из человеческих эмбриональных стволовых клеток

Здравствуйте, меня зовут Стефан Бурани, я работаю в лаборатории доктора Фрэнка Завы на кафедре биохимии Калифорнийского университета в Риверсайде. Сегодня мы продемонстрируем процедуру иммунопреципитации хроматина. Итак, приступим.

Данная процедура начинается с кросс-линкинга эмбриональных стволовых клеток человека формальдегидом. Перед кросс-линкингом эмбриональные стволовые клетки человека размораживают из жидкого азота в течение пяти минут при 37 °C, после чего промывают средой. Затем клетки высевают на шестилуночные планшеты, покрытые желатином, и оставляют для экспансии на два-три дня.

Для каждой реакции иммунопреципитации потребуется от 50 до 100 миллионов клеток. Сначала клетки подвергаются лизису и собираются в виде суспензии. В каждую клеточную суспензию добавляют свежеприготовленный раствор альдегида в концентрации 1% и инкубируют в течение 10 минут при комнатной температуре.

Затем добавьте 1/10 объема 1,25 M глицина для нейтрализации формальдегида и инкубируйте в течение 10 минут. Двежды промойте клетки 10 мл PBS, после чего перенесите их в конические пробирки объемом 50 мл. Центрифугируйте пробирки при 1000 об/мин в течение пяти минут при 4 °C для осаждения клеток.

После центрифугирования удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в 1,5 миллилитрах лизирующего буфера. Затем перенесите клетки в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра. После переноса клеток подвергните их трехкратному быстрому замораживанию в жидком азоте, а затем измельчите с помощью гомогенизатора тканей.

После сшивания клеток они готовы к иммунопреципитации или могут быть хранились в замороженном состоянии при температуре минус 80 °C неопределенно долго. После сшивания клеток необходимо подготовить магнитные бусины. В микроцентрифужные пробирки с низким уровнем удерживания объемом 1,5 мл добавьте по 50 µL бусин; подготовьте одну пробирку с бусинами для каждой иммунопреципитации.

Затем добавьте один миллилитр блокирующего раствора. Теперь соберите магнитные частицы с помощью магнитного сепаратора MPC. Поместите пробирки в магнитный штатив.

Дайте гранулам собраться у стенки пробирки. Это должно занять около 15 секунд. Чтобы ускорить сбор гранул, можно дважды перевернуть штатив.

После сбора гранул удалите супернатант с помощью пипетки. После удаления супернатанта добавьте 1 мл блокирующего раствора и аккуратно ресуспендируйте гранулы, извлекая магнитную полосу из штатива и переворачивая штатив. Не вынимая пробирку, повторите это действие 10–20 раз или до тех пор, пока гранулы не распределятся равномерно.

Повторно суспендируйте и соберите гранулы, как вы делали это ранее. После сбора удалите супернатант с помощью пипетки. Повторите данную промывку, используя 1,5 milliliters блокирующего раствора.

После второй промывки можно ресуспендировать гранулы в 750 µL блокирующего раствора, а затем добавить 10 µg антител. В нашем исследовании мы используем антитела к белку MLL; смесь инкубируют при температуре 4 °C минимум шесть часов или в течение ночи на ротаторе. Во время этой инкубации вы можете подвергнуть хроматин, сшитый с белками, воздействию ультразвука, что мы продемонстрируем сразу после ночной инкубации.

Удалите раствор антител, затем трижды промойте гранулы. Используйте один миллилитр лиазного буфера, как и ранее, используя магнитный штатив для сбора гранул. После промывок можно приступать к добавлению насыщенного хроматина.

Перед началом соникации необходимо извлечь замороженные осадки клеток из морозильной камеры при -80 °C и дать им оттаять. Подготовьте коническую пробирку объемом 15 мл для соникации. Для этого разрежьте пробирку на две части по отметке 5 мл и удалите верхнюю половину.

Пробирки можно закрыть парафильмом или крышкой пробирки. При настройке установите пробирку в штатив таким образом, чтобы зонд автотора находился примерно на расстоянии от 0,5 до 1 см над дном пробирки.

Убедитесь, что зонд центрирован и не касается стенки пробирки, чтобы предотвратить вспенивание раствора. Затем подвергните суспензию соникации в течение шести циклов по 20 секунд. Между циклами соникации каждый образец следует выдерживать в бане с ледяной водой для уменьшения вспенивания.

Сначала установите выходную мощность на ноль, затем вручную увеличьте её до конечного значения во время первого импульса. После завершения процедуры перенесите материал в пробирку объемом 1.5 мл и центрифугируйте при 13 000 RPM в течение 10 минут при температуре four degrees Celsius, чтобы осадить клеточный дебрис и собрать супернатант.

Перенесите SINA в новую пробирку объемом 1,5 мл. Сохраните 50 µL клеточного лизата из каждого образца в качестве исходной ДНК. Это понадобится позже для проверки размера фрагментированного хроматина.

Этот образец можно хранить при температуре -20 °C. Для каждой партии соникационного лизата следует сохранить как минимум одну аликвоту входной ДНК. Теперь мы готовы приступить к иммунопреципитации хроматина.

Сначала добавьте количество хроматина, эквивалентное 50–100 миллионам клеток, собранных на предыдущем этапе, к 50 мкл смеси магнитных бусин с антителами, приготовленной ранее, до достижения конечного объема одного миллилитра. При необходимости этот объем можно довести до нужной отметки с помощью лизирующего буфера; переверните пробилку для ресуспендирования бусин. Инкубируйте данную смесь в течение ночи в ротаторе при температуре 4 °C.

После инкубации соберите гранулы с помощью магнита MPC, поместите пробирки в штатив, чтобы гранулы скопились у стенки пробирки. Этот процесс должен занять примерно 20 секунд. Дважды встряхните штатив, чтобы помочь собрать все гранулы.

Затем удалите супернатант с помощью пипетки, меняя наконечники между образцами. Далее необходимо промыть бусины. Для этого добавьте один миллилитр буфера лиазы в каждую пробирку и осторожно ресуспендируйте бусины.

Это можно сделать, извлекая магнитную полоску из штатива и переворачивая штатив с установленными в нем пробирками примерно от 10 до 20 раз или до равномерного ресуспендирования бусин. После этого соберите бусины, вернув магнитную полоску на место. Удалите супернатант с помощью пипетки.

Повторите эту промывку еще от трех до пяти раз. Не забывайте менять наконечники между промывками. Затем промойте гранулы от четырех до шести раз в 1 мл буфера IP 1, как описано выше.

Затем аналогичным образом промойте гранулы четыре-шесть раз в 1 мл буфера IP two. В завершение промойте гранулы четыре-шесть раз в 1 мл ТЕ-буфера (pH 8,0), как и при предыдущих промывках. После финальной промывки удалите ТЕ-буфер.

Теперь центрифугируйте при 3000 RPM в течение трех минут при четырех градусах Цельсия, чтобы удалить остатки буфера TE. Теперь гранулы готовы к элюции для удаления хроматина. Сначала добавьте 210 µL элюционного буфера и элюируйте материал с гранул, инкубируя пробирки в термомиксере при 65 градусов Цельсия и 800 RPM в течение 15 минут или до 30 минут для повышения степени извлечения элюата.

Центрифугируйте гранулы при 13 000 RPM в течение одной минуты. После центрифугирования удалите 200 мкл супернатанта, перенесите его в новую пробирку и добавьте 200 мкл TE буфера. Теперь образцы готовы к процедуре обратного сшивания для депреципитации иммонопреципитированной ДНК.

Инкубируйте супернатант в водяной бане при температуре 65 °C в течение минимум шести и максимум 15 часов. Инкубацию следует проводить в водяной бане, чтобы минимизировать конденсацию. Затем добавьте 50 µL исходной ДНК.

После этого обратная длина перекрестных связей данной входной ДНК была восстановлена путем инкубации при 65 °C, аналогично обработке элюата. Теперь мы готовы к очистке ДНК. Затем ДНК очищают и осаждают с помощью экстракции фенол-хлороформом с последующим осаждением этанолом.

Осажденные пеллеты ДНК ресуспендируют в воде, после чего их можно хранить при температуре -20 °C. Для последующего использования очищенную исходную ДНК можно подвергнуть электрофорезу в агарозном геле, чтобы проверить размер фрагментированного хроматина. В идеале длина фрагментов должна составлять от 250 до 750 оснований.

Таким образом, мы продемонстрировали, как проводить иммунопреципитацию хроматина из эмбриональных стволовых клеток человека. При выполнении этого эксперимента важно использовать антитела с высоким аффинитетом, хроматин соответствующего диапазона размеров и этапы промывки с высокой строгостью. На этом всё.

Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.