Первичная диссоциированных мозга Допамин клеточных культур от грызунов Новорожденные

Здравствуйте, я Лорен Фрэнк из лаборатории Эммануэля Потоса на кафедре фармакологии и экспериментальной терапии медицинского факультета Университета Тафтса. А я — Эммануэль Потос. Сегодня мы продемонстрируем вам методику получения первичных культур дофаминергических нейронов среднего мозга из новорожденных грызунов.

Данная процедура включает в себя следующие этапы: подготовку инструментов и реагентов, диссекцию среднего мозга грызунов от P0 до P2, приготовление суспензии сегментов мозга и высев диссоциированных нейронов. Приступим к работе.

В данной процедуре предусмотрен ряд подготовительных этапов, которые необходимо выполнить за две-три недели до создания культуры дофаминергических нейронов: необходимо высеять глиальные клетки, чтобы они успели пролиферировать и покрыть дно чашек. Первичные дофаминергические нейроны будут культивироваться на монослое глиальных клеток за один-семь дней до начала культивирования первичных нейрональных клеток. За день до культивирования AC удалите среду из культур глиальных клеток и замените ее двумя миллилитрами свежей нейрональной среды; все предметы, за исключением инструментов для диссекции, включая 12 диссекционных планшетов, должны быть стерилизованы с помощью УФ-излучения.

Две пробирки для диссоциации с микромагнитным перемешивателем. Две крышки для пробирок с двумя небольшими отверстиями в верхней части. Разложенные разделительные кольца.

И не забудьте оставить открытым бокс с предметными стеклами. Перед началом работы в день культивирования все эти инструменты обрабатывают 70% ethanol. Сначала из морозильной камеры извлеките все компоненты для приготовления раствора pepane, который будет использоваться для диссоциации первичного нейронального раствора, и дайте им разморозиться.

Установите нагревательную плитку для подогрева стакана с водой до 34 °C для проведения дигестии и подготовьте воду, насыщенную карбогеном, для оксигенации раствора пепана. Во время дигестии подготавливают 15 стерильных пробирок, заполненных четырьмя-шестью миллилитрами стерильного PBS для промывки мозга перед диссекцией, и помещают их на лед. Отмеряют 20–30 миллилитров свежей нейрональной среды и помещают ее в инкубатор.

Затем подготавливают флакон для диссоциации: раствор пепана фильтруют через стерильный фильтр-переливник и переносят во флакон для диссоциации объемом 25 мл. Закрывают флакон крышкой, в которой проделывают отверстие для вставки стерильного шприца, подключенного к фильтру с порами 0,2 мкм. К фильтру подключают карбоген и фиксируют соединение парафильмом. Флакон помещают в пенопластовый диск.

После установки пробирки для диссоциации убедитесь, что магнитный перемешиватель работает. Газ поступает в пробирку, а температура стабилизирована на уровне 34 °C. Стереомикроскоп помещают в вытяжной шкаф, а инструменты для диссекции раскладывают на алюминиевой фольге.

Затем разложите один большой квадрат алюминиевой фольги и 12 квадратов меньшего размера. Подготовьте ножницы для обрезки фольги. Поместите пенопластовый контейнер с ледяной водой снаружи вытяжного шкафа.

Затем подготовьте анестетик, представляющий собой смесь 0,075 мл кетамина и 0,075 мл ксилазина. Затем возьмите не менее 12 щенков от P0 до P2 для планшетов 135 мм с 23-миллиметровыми стеклянными лунками для мышей; убедитесь, что генотип всех щенков в одном помете совпадает.

Если генотип неизвестен, клетки от каждого животного необходимо будет высеять в отдельные чашки, ведя точный учет для последующего сопоставления клеток с результатами генотипирования. Для начала диссекции анестезируйте первое животное путем внутрибрюшинной инъекции кетамина и ксилазина. Когда животное перестанет реагировать на тест с щипком за хвост, поместите его в ледяную воду на 30 секунд до развития гипотермии.

Затем промойте один небольшой квадрат из алюминиевой фольги, ножницы для декапитации и голову животного 70% ethanol, чтобы избежать контаминации тканей мозга во время диссекции; выполните декапитацию ножницами, дав голове упасть на квадрат из алюминиевой фольги, и переместите её под вытяжной шкаф. Осторожно извлеките мозг, предварительно разрезав кожу маленькими ножницами, чтобы обнажить череп. Сделайте разрез вокруг черепа на 360 градусов.

Затем осторожно снимите колпачок черепа с помощью пинцета. Извлеките мозг из черепной коробки с помощью маленького шпателя и поместите его в 15 миллилитровую пробирку с холодным PBS на льду. Прежде чем извлекать следующий мозг, верните пробирку на лед.

Повторяйте процедуру диссекции до тех пор, пока в отдельных пробирках на льду не окажется три мозга. Перенесите один мозг и PBS в первую чашку для диссекции. Под микроскопом поместите мозг на слой клея Sill Guard, который послужит амортизатором для сохранения остроты лезвия.

С помощью переносной пипетки перенесите сегменты в новую пробирку с PBS, чтобы промыть их перед переносом в раствор папаина. Запустите таймер, когда поместите первые сегменты, и продолжайте диссекцию до тех пор, пока все головные мозги не окажутся в процессе переваривания папаином.

Первые сегменты мозга будут перевариваться около одного часа. К моменту добавления последних сегментов дайте процессу переваривания продолжаться еще один час. Убедитесь, что температура в пепановой бане стабилизирована на уровне 34 °C.

Для начала этапа титрации с помощью переносной пипетки поместите сегменты мозга в стерильную пробирку объемом 15 мл. Старайтесь не переносить избыточный раствор пепаина. Если же это произошло, удалите излишки пепаина.

Затем промойте сегменты, добавив два миллилитра подогретой нейрональной среды из инкубатора. Дайте сегментам осесть, после чего осторожно удалите максимально возможный объем раствора, чтобы не сместить сегменты. Всего необходимо провести три такие промывки.

Не забывайте менять пипетки между промывками, чтобы избежать контаминации, используя каждую новую порцию раствора. Начните итерации в 2 mL нейрональной среды. Проведите тритурацию 25 раз, стараясь не допустить появления пузырьков воздуха.

Затем дайте неассоциированным сегментам осесть в течение трех минут. С помощью переносной пипетки соберите как можно больше супернатанта, не затрагивая сегменты на дне. Перенесите супернатант в новую стерильную пробирку объемом 15 миллилитров.

Повторите предыдущий шаг, используя наконечник дозатора на 1000 мкл, а затем на 200 мкл, после чего сегменты должны казаться полностью диссоциированными при визуальном осмотре. Супернатант после всех манипуляций собирают в одну и ту же пробирку объемом 15 мл. Теперь клетки готовы к посеву. В завершение перенесите клетки 10 раз с помощью transfer pipette, чтобы получить гомогенную клеточную суспензию для подсчета.

Используя стерильный желтый наконечник для пипетки, накройте каждый конец пинцета. Осторожно поместите кольцо для предметного стекла, стараясь максимально центрировать его относительно стекла. Эти кольца внутри каждой чашки будут использоваться для изоляции области в чашке для культивирования, в которой будут высеяны нейроны.

С помощью наконечника пипетки сдвиньте кольца так, чтобы они охватывали центральную лунку каждой чашки. Осторожно внесите в чашку соответствующий объем суспензии клеток. Добавляйте клетки в центр кольца, которое вы предварительно установили в чашку.

Не забудьте менять наконечники для каждой лунки. Затем добавьте 100 µL разведенного раствора GDNF максимально близко к внешнему краю кольца в каждой лунке, чтобы стимулировать пролиферацию нейронов. Далее за пределы кольца добавьте ингибитор митоза фтордиоксин (FDU), чтобы предотвратить избыточный рост глиальных клеток.

Кончики дозаторов часто возвращают в инкубатор, позволяя клеткам осесть на ночь. На следующий день, используя стерильные наконечники дозатора для прикрытия кончиков пинцета, снимите кольца, верните чашки в инкубатор и старайтесь минимально тревожить их до начала экспериментов. Ежедневно проверяйте чашки на наличие возможного загрязнения; при его обнаружении немедленно удалите проблемные чашки. Культуры готовы к использованию в электрофизиологии, молекулярно-биологических экспериментах и иммуноцитохимии в течение трех недель.

Теперь, когда клетки посеяны, давайте рассмотрим несколько репрезентативных примеров клеток в культуре. Здесь представлена первичная культура, посеянная 14 дней назад. Это пример качественной культуры, так как видны отчетливые тела клеток с отходящими от них отростками.

Кроме того, обратите внимание на отсутствие в чашке плесени или грибкового роста, которые могли бы указывать на контаминацию. Мы продемонстрировали вам способ получения первичных диссоциированных культур дофаминергических нейронов среднего мозга из новорожденных грызунов. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости соблюдения стерильности, использования только новорожденных животных от P0 до P2, посева на здоровые глиальные субстраты с использованием кондиционированной глиальной среды, а также поддержания постоянной плотности посева.

На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.