Применение допамина Элеганс C. Анализ дегенерация нейронов для проверки потенциальных болезни Паркинсона Гены

В лаборатории Колдуэлла, также известной как «Червячный домик», мы изучаем механизмы неврологических заболеваний у *C. elegans*. И после долгого дня плодотворных экспериментов мы вознаграждаем себя развлекательными занятиями. Здравствуйте, я Адам Найт, студент бакалавриата из лаборатории Колдуэлла факультета биологических наук Университета Алабамы.

Сегодня я и мои коллеги продемонстрируем, как провести анализ дегенерации дофаминергических нейронов у C. elegans. Я скрещу линию червей с дофаминергической нейродегенерацией с трансгенными линиями, в которых сверхэкспрессированы гены-кандидаты, связанные с заболеванием, и дофаминергические нейроны. Здравствуйте, я Адам Харрингтон, аспирант лаборатории Колдуэлла.

Сегодня я покажу вам, как подготовить трансгенных червей для анализа дофаминергических нейронов. Здравствуйте, меня зовут Шу Амичи, я аспирант. В этом видео я продемонстрирую, как проводить анализ дофаминергических нейронов *C. elegans*, которые называются CEPS и AIDES.

Как правило, черви, экспрессирующие только GFP в дофаминергических нейронах, не проявляют признаков гибели клеток. Однако в присутствии CLE вы заметите их гибель и возрастную нейродегенерацию. Используя этот анализ, можно коэкспрессировать трансген в дофаминергических нейронах, чтобы определить, способен ли он усиливать или подавлять токсичность, индуцированную CLE. Итак, приступим.

Перед проведением анализа дофаминевых нейронов необходимо сначала скрестить соответствующие штаммы GaN, чтобы начать перенос восьми червей, экспрессирующих как alphas nucle и GFP под контролем специфичного для дофаминевых нейронов промотора dat one, на спаривательную пластину. Теперь добавьте двух трансгенных особей C. elegans стадии L4, которые демонстрируют специфическую экспрессию нашего исследуемого гена-кандидата в дофаминовых нейронах, а также экспрессию флуоресцентного селективного маркера DS red two в клетках мышц телостной стенки. Важно отметить, что для каждой трансгенной конструкции мы создаем три стабильные трансгенные линии.

Таким образом, этот генетический скрещивание следует проводить индивидуально для каждой из трех созданных отдельных стабильных линий. Через два дня удалите и утилизируйте самцов спустя еще два-три дня. Осмотрите поколение F1.

Присутствуют несколько мужских потомков, что свидетельствует об успешном скрещивании. Далее индивидуально перенесите на новые чашки по пять животных стадии L4 из скрещивания Aphrodite L и по четыре животных из каждого другого скрещивания, которые экспрессируют как флуоресцентный маркер GFP, унаследованный от отца, так и флуоресцентный маркер мышц телостенки DS red 2, унаследованный от родителя hamadi. Переносимые животные должны находиться на стадии L4, чтобы гарантировать, что они еще не прошли через стадию гермафродитизации.

При наличии самцов на чашке оставьте животных для самооплодотворения на три-четыре дня для получения потомства F2. Теперь следует отобрать потомство F2: перенесите от пяти до 10 особей, имеющих оба центромерных маркера, на отдельные индивидуальные чашки.

Затем проведите скрининг поколения F3, чтобы отобрать планшеты, в которых сто процентов животных экспрессируют GFP в дофаминергических нейронах, а некоторые из них экспрессируют флуоресцентный маркер DS red two в клетках мышц телостной стенки. Такие животные будут гомозиготны по генам альфа-синуклеина и GFP, а также будут стабильно передавать недавно созданный трансген. После завершения скрининга можно приступать к анализу дофаминергических нейронов.

Для начала анализа нейронов подготовьте свежие чашки с животными трех линий, определенными на предыдущем этапе. Подготовьте отдельную чашку для каждой из трех трансгенных линий. Кроме того, в качестве контроля используйте линию, экспрессирующую только GFP-альфа-синуклеин; дайте червям вырасти до взрослого состояния.

Когда черви достигнут взрослой стадии, перенесите от 30 до 40 трансгенных особей каждой линии на свежую чашку. Оставьте их для откладки яиц на пять часов при температуре 20 °C. По истечении пяти часов удалите и утилизируйте их.

Взрослых особей оставляют до развития эмбрионов в течение трех-четырех дней при 20 °C до достижения ими стадии L4. Затем примерно сто трансгенных животных стадии L4 переносят на чашку с 0,04 mg/mL 5-фтор-2'-дезоксиуридина.

Этот аналог нуклеотида предотвращает развитие следующего поколения путем ингибирования синтеза ДК. Поскольку чашки с FDUR чувствительны к свету, защищайте их от освещения, храня чашки под крышкой и полностью обернув их. Подготовьте большой agar-пад для анализа червей.

Их следует использовать свежими, не допуская высыхания. Подготовьте два предметных стекла, на которые вдоль наклеена полоска скотча. Скотч служит разделителем для создания подушечек одинаковой толщины.

Положите третий предметный стеклышко между ними на лабораторный стол. Теперь они расположены в ряд, по три штуки.

Поместите каплю расплавленного агарозы в центр предметного стекла и быстро накройте сверху вторым стеклом перпендикулярно первому, чтобы зафиксировать все три стекла. Повторите процедуру, чтобы изготовить несколько дополнительных агарозных подушечек в количестве, необходимом для анализа всех образцов. После того как агарозные подушечки будут готовы, нанесите каплю 6 µL 3 mM анестетика в концентрации 11 M на покровное стекло размером 22 × 30 мм.

Перенесите 40 взрослых животных в каплю, а затем накройте их покровным стеклом, приложив его к агарозному подушечке. Повторите процедуру для всех остальных линий. Проведите оценку 30 животных каждой линии на наличие каждого CEP-нейрона и D-нейрона.

Используя сложный микроскоп с эпифлуоресценцией и фильтр-кубом, позволяющим визуализировать FITC или GFP, мы применим фильтр-куб endo G-F-P-H-Y-Q для записи данных в оценочный лист. Животные дикого типа сохраняют полную экспрессию GFP в четырех нейронах CEP и двух нейронах A DE. Отдельные животные с признаками потери нейронов D классифицируются как дикий тип или дегенерирующие.

Эти нейроны регистрируются как LG или потеря GFP. Аналогично, степень дегенерации может быть оценена путем подсчета общего количества потерянных нейронов у каждого животного, а также популяции; анализ повторяется еще два раза. В каждом испытании используется по 30 дополнительных животных для каждой линии.

Вычисляется среднее общее количество червей с дофаминергическими нейронами дикого типа по результатам трех раундов анализа. Затем проводится статистический анализ нейропротекции с использованием t-критерия Стьюдента, при этом значение P менее 0,05 считается значимым. Для сравнения контрольных червей со штаммами, в которых происходит гиперэкспрессия генов-кандидатов в дофаминергических нейронах, данный анализ проводится в разные дни после откладки яиц; подходящие дни анализа определяются эмпирически.

Например, мы установили, что у 77%, 87% и 90% животных с alpha CLE плюс GFP наблюдается дегенерация дофаминергических нейронов на шестой, седьмой и десятый дни после развития соответственно. Следовательно, если мы предполагаем, что интересующий нас трансген может усилить нейродегенерацию, анализ будет проводиться на шестой день. Аналогично, трансгены, которые могут подавлять нейродегенерацию, будут анализироваться на седьмой и десятый дни.

Мы только что продемонстрировали вам, как провести анализ нейродегенерации дофаминергических нейронов у C. elegans. При выполнении данной процедуры важно помнить о следующем: во-первых, используйте соответствующий маркер для селекции при генетических скрещиваниях; во-вторых, для скрещиваний используйте здоровых самцов и личинок стадии L4.

И третье, убедитесь, что вы тщательно и последовательно подсчитываете нейроны CEP и DE. Эта процедура позволит вам быстро оценивать генетические факторы, которые могут усиливать или подавлять нейродегенерацию, индуцированную alpha-CLE. На этом всё.

Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.