Парадигмы для Фармакологические Характеристика C. Элеганс Synaptic Мутанты передачи

Здравствуйте, я Коди Локк из лаборатории Колдуэлла на факультете биологических наук Университета Алабамы. Меня зовут Кайл Ли, и я покажу вам, как подготовить червей к анализам на воздействие углеводов и PTZ. Меня зовут Бернард Ту, и я продемонстрирую вам, как проводить анализы углеводов.

Меня зовут Кейлин Берри, и я отвечаю за видео о морской элегантности. В этой презентации я расскажу об этой презентации и продемонстрирую анализ воздействия PTZ. Сегодня мы с коллегами покажем, как охарактеризовать мутантов синаптической передачи с помощью модели эпилепсии с морской элегантностью после воздействия PTZ и углеводов Alde с серией репрезентативных мутантных штаммов.

Итак, приступим. Кайл Ли начнет с того, что покажет подготовку анализов на углеводы АЛД в первый день процедуры. Убедитесь, что на второй день для анализа на углеводы АЛД будет доступно не менее 30 молодых взрослых червей каждого генотипа и каждой реплики.

Лучше всего, если экспериментатор выберет 50 или более L четырехступенчатых червей на свежих пластинах без фунгицидов NGM, сидящих с кишечной палочкой OP 50 в качестве источника пищи. Выращивайте червей в течение 12-24 часов при постоянной и разрешающей температуре. Лучше всего от 20 до 22 градусов по Цельсию, хотя допустимо 25 градусов по Цельсию.

На второй день приготовьте 100 миллимолярный стоковый раствор Al Decarb и 70% этанола распределите соответствующее количество Al Decarb на пластины NGM. Мы постоянно используем 0,5 миллимолярного аль декарба, помещая 37,5 микролитров 100 миллимолярного альде карба на 60-миллиметровые невентилируемые пластины Петри с 7,5 миллилитров в граммах. Дайте пластинам alde carb высохнуть примерно от 30 до 60 минут при комнатной температуре.

Не стоит трескать крышки после того, как пластины высохнут. Добавьте равномерные объемы кишечной палочки в центр каждой пластины с углеводами alde и высушите еще от 30 до 60 минут. При комнатной температуре мы обычно добавляем 25 микролитров кишечной палочки OP 50.

Такой объем ОП 50 создает достаточно большую пищевую лужайку, чтобы держать червей в небольшом месте в центре тарелки без перенаселенности. Как только продовольственная лужайка высохнет, приступайте к анализу углеводов alba. Из-за субъективного характера анализов на углеводы АЛД настоятельно рекомендуется проводить эксперименты вслепую.

Для этого нужно. Коллега основного экспериментатора перемаркирует исходные пластины, содержащие червей, подлежащих анализу, или же он может перенести червей с оригинальных пластин на зашифрованные пластины alde carb непосредственно перед запуском таймера. Теперь, когда пластины были выбраны, бор АВО приступит к анализу, чтобы начать подсчет количества парализованных червей.

Существует два основных подхода к определению острого паралича, вызванного ал-декарбюром. Первый подход определяет паралич прекращением откачивания глотки. На этом видео изображена темная структура, расположенная в просвете глотки червя в правой части экрана.

Эта структура называется кофемолкой и ритмично сжимается с помощью холинергического механизма. Передвижение червя на этом видео было значительно замедлено из-за воздействия Al Decarb. Тем не менее, глоточная болгарка этого червя все еще явно движется.

Таким образом, этот червь не парализован прекращением откачки определения. На этом видео следует видеть, что глоточная мельница, расположенная в правой части экрана, не сокращается с прекращением откачки, как рабочим определением для паралича, вызванного аль-декарбом. Этот червь должен быть оценен как парализованный.

Однако, как и червь в предыдущем видео, этот червь демонстрирует небольшие движения из стороны в сторону, добывая пищу. Несмотря на то, что его передвижение нарушено из-за Al Decarb, эти движения не позволили бы экспериментатору считать этого червя парализованным при втором подходе к определению Al Decarb индуцированного паралича, неподвижности всего тела и невосприимчивости к прикосновениям. Второй подход к определению паралича, вызванного ал-декарбюром, включает в себя последовательное проталкивание каждого червя платиновой проволокой и проверку реакции.

Если движения тела не могут быть замечены невооруженным глазом, мы предпочитаем дважды тыкать червей в голову и дважды в хвост каждые 30 минут в течение трех часов. Как вы должны видеть, червь на этом видео явно не двигает своим телом. Тем не менее, поскольку этот червь реагирует на толчок четким движением хвоста, мы не называем его парализованным.

По второму определению аль-декарб индуцирован параличом. Как и червь в предыдущем видео, этот червь явно не двигает своим телом и поэтому нуждается в тесте на подталкивание. Тем не менее, в отличие от червя из предыдущего видео, этот червь не реагирует четко на подталкивание.

Таким образом, этот червь парализован по второму признаку паралича, вызванного декарбом. Хотя разница между парализованным и непарализованным альдекарбом может быть незначительной, экспериментаторы должны быть в состоянии выявить существенные изменения и синаптическую передачу, просто наблюдая за большим количеством репрезентативных червей, подвергшихся воздействию Аль Декарба сразу после того, как они были выбраны на пластинах с Аль Декарбом. Черви дикого типа еще подвижны.

В этом видео. Вы увидите тех же червей дикого типа из предыдущего видео после одного часа воздействия Al Decarb. Обратите внимание, что черви в некоторой степени замедляются, но все еще явно движутся.

В отличие от червей дикого типа, мутанты Tomasin one в этом видео либо полностью обездвижены, либо едва двигаются после одного часа воздействия. Этот результат согласуется с тем, что мутанты томазина 1 имеют избыточную секрецию ацетилхолина из-за неспособности отрицательно регулировать высвобождение нейротрансмиттеров в нервно-мышечных соединениях, избыток ацетилхолина и синаптические щели в нервно-мышечных соединениях в сочетании с ингибированием деградации ацетилхолина, Bial Decarb делает мутантов томазина одного из гиперчувствительных, хотя здесь не показано, аналогичные результаты были постулированы как полученные из анализов Alde Carb с потерей функциональных аллелей ON 43, который кодирует C elegance ortho log кальция кальциевая мулин-зависимой протеинкиназы два. В этом видео показано 25 мутантов, которые испытывают дефицит ингибиторной ГАМКергической передачи.

После одного часа воздействия alde carb, аналогичного мутантам томазина 1 и M 43, эти мутанты демонстрируют значительные двигательные нарушения, индуцированные alde carb, и, по-видимому, более подвержены воздействию, чем черви дикого типа, подвергающиеся воздействию al Decarb в течение идентичного периода времени. Этот результат согласуется с тем, что у мутантов М 25 наблюдалась гиперстимуляция мышц стенки тела в результате комбинации воздействия аль-декарба и сниженной передачи ГАМК, что приводило к увеличению возбуждающе-тормозной передачи в нервно-мышечных соединениях CL ELs и последующему параличу. Тем не менее, потому что мутанты томазина 1 на 43 и на 25 проявляют схожую чувствительность к Al Decarb на данный момент времени.

Несмотря на различные причины чрезмерной стимуляции мышц стенок тела, экспериментатор не мог знать основной механизм гиперчувствительности, не зная сначала причинных мутаций. Для этого видео мы вернулись к тому же дикому типу червей из более раннего видео, что и после трех часов воздействия аль декарба в этой конечной точке нашего анализа на углеводы ALD, должно быть ясно видно, что эти черви, несмотря на дикий тип, либо полностью обездвижены, либо едва двигаются. Эти черви в настоящее время фенотипически сходны с мутантами TOM one и M 25, показанными через час после воздействия alde carb, по-видимому, из-за того, что возбуждающая холинергическая передача достигла сопоставимых уровней, в отличие от червей дикого типа, мутанты Synap Bren one остаются значительно подвижными при трехчасовом воздействии alde carb.

Этот результат согласуется с мутантами Synaptive Bren one, у которых отсутствует нормальный уровень секреции нейротрансмиттеров, и у которых меньше холинергической стимуляции в мышцах стенок тела, чем у древесных червей дикого типа, после идентичных уровней воздействия углеводов alde в это время. Мутанты Point on four, которые имеют специфический дефицит холинергической передачи, должны иметь такую же чувствительность к Al Decarb, как и мутанты Synaptive Bren one. И наоборот, гиперчувствительные мутанты Tomasin one и O 25 остаются парализованными, в отличие от червей дикого типа.

Стоит отметить, что некоторые черви, особенно устойчивые к Al Decarb, могут попытаться сползти с пластины. В этом случае экспериментатор может распылять постоянное количество пальмитиновой кислоты, что является физическим барьером для передвижения червей. Вокруг пластин Al Decarb мы размазываем 25 микролитров 10 миллиграммов пальмитиновой кислоты на миллилитр этанола.

На этом мы завершаем парадигму воздействия Al Decarb. Теперь я продемонстрирую парадигму воздействия Penta Lean Terazol. Кейлин Берри будет помогать нам с PTZ-анализами.

Подготовка червей к PTZ-пробам по сути такая же, как подготовка червей к пробам на альде-углеводы. Единственные существенные различия между двумя анализами заключаются в следующем. В качестве растворителя PTZ мы используем DDH 2 O вместо 70% этанола.

Кроме того, поскольку мы часто покрываем большие объемы PTZ, чем карбюратор ALDE, мы даем пластинам высохнуть не менее одного часа перед добавлением OP 50. Пальмитиновая кислота также может использоваться с PTZ. Кроме того, важно отметить, что PTZ гораздо менее стабилен, чем альде карбюратор и должен храниться при температуре минус 20 градусов по Цельсию.

Для начала анализа подсчитайте количество эпилептических световых конвульсивных червей каждые 30 минут в общей сложности в течение одного часа. Лучше всего оценивать количество червей с различными типами судорог в отдельные категории, такие как конвульсии всего тела, передние конвульсии, которые мы называем комбинацией передних конвульсий с параличом мышц стенки тела, который мы называем тонико-клоническим или полным параличом тела, который мы называем тоническим тоником. Судорожная активность, наблюдаемая у червя справа, часто следует за тонико-клоническими конвульсиями, как у червя на левом тонике.

Судорожная активность может быть просто результатом мышечной усталости после повторяющихся тонико-клонических конвульсий. Тем не менее, наши неопубликованные данные указывают на то, что некоторые черви могут стать тонизирующим на PTZ способом, аналогичным параличу, вызванному аль-декарбном, без предварительного тонико-клонического эффекта. Здесь мы показываем репрезентативное ползание синаптического трансмиссионного мутантного червя в отсутствие антагониста рецептора PTZA GABA и общего индуктора припадков в различных животных моделях судорог и эпилепсии.

Обратите внимание, что кончик или нос червя раскачиваются из стороны в сторону во время добывания пищи. В этом видео мы показываем еще одного червя из того же мутантного штамма синаптической передачи, который использовался в предыдущем видео. Обратите внимание, что этот червь, который в присутствии 2,5 миллиграмма PTZ на миллилитр воды, в основном продолжает двигать головой из стороны в сторону во время добывания пищи.

Тем не менее, этот червь время от времени останавливается в поисках пищи из стороны в сторону и вместо этого многократно выталкивает свой передний червь вперед. Наконец, следует увидеть червя, который несет ту же мутацию, что и черви в предыдущих двух видео, в присутствии 10 миллиграммов PTZ на миллилитр воды. Обратите внимание, что этот червь уменьшил время кормления из стороны в сторону и выталкивает свой передний вперед с большей частотой и интенсивностью, чем при более низкой концентрации PTZ.

Эти результаты демонстрируют дозозависимость PTZ, которую мы наблюдаем со всеми чувствительными к PTZ мутантами синаптической передачи. Важно отметить, что воздействие PTZ недостаточно для того, чтобы вызвать эпилептические судороги у червей дикого типа. Кроме того, мы пытались, но не наблюдали индуцированные ПТЗ эпилептические судороги у червей со специфическим дефицитом холинергической передачи, таких как у четырех червей, или у червей с чрезмерной холинергической передачей, таких как томазин.

Таким образом, должно быть возможным дальнейшее определение характеристик мутантов синаптической передачи с устойчивостью к альде-углеводам либо от дефицита общей синаптической функции, либо от специфического дефицита холинергической передачи, основываясь на их относительной чувствительности к PTZ. Возможно, удивительно, но сильное снижение функции мутанта ONC 25, которому не хватает обнаруживаемой экспрессии ГАМК в элегантности C. Тормозные моторные нейроны не проявляют спонтанных эпилептических световых судорог, как видно на этом видео.

Мутант ONC 25 на 10 миллиграммах PTZ на миллилитр воды. Тем не менее, проявляет сильные тонико-клонические конвульсии, хотя и не проявляется, только передние конвульсии с некоторым движением предшествовали ONC 25 ассоциированным тонико-клоническим конвульсиям и имитировали конвульсии мутантов synap Bren one. Поэтому экспериментатору не следует предполагать, что все ингибирующие мутанты ГАМК будут проявлять тонико-клонические судороги или тесно связанную с ними тоническую судорожную активность в присутствии ПТЗ, особенно учитывая вероятность получения гипоморфных мутантных аллелей.

Теперь, когда мы продемонстрировали гиперчувствительность к альдовым углеводам и к PTZ у ингибиторных мутантов ГАМК, но только гиперчувствительность к альдовым углеводам и нормальную чувствительность к PTZ у мутантов, лишенных негативной регуляции холинергической передачи. Можно задаться вопросом, как выглядят мутанты с потерей функции UNC 43 на PTZ, поскольку они также гиперчувствительны к углеводу Alda, как и другие наши мутанты синаптической передачи на 43 мутантах, не проявляют явных эпилептических конвульсий в отсутствие PTZ, хотя у этих мутантов есть редкие неповторяющиеся, но все же спонтанные сокращения всего тела еще после воздействия 10 миллиграммов PTZ на миллилитр воды на 43. Присутствуют мутанты с потерей функции, сильные, повторяющиеся и дозозависимые судороги всего тела. В настоящее время эти результаты неоднозначны, но, по-видимому, указывают на то, что ON 43 не должен играть специфическую роль в ингибиторной ГАМКергической передаче или играть роль только в негативной регуляции высвобождения нейротрансмиттеров.

В нервной системе C elegance мы только что показали вам, как охарактеризовать мутанты синаптической передачи CL elgan с помощью комплементарных нервных стимуляторов, alde carb, ингибитора холинэстеразы и антагониста рецепторов PTZA ГАМК. Следуя любой из дополнительных фармакологических парадигм, помните, что степень чувствительности к одному нервному стимулятору не может предсказать степень чувствительности к другому нервному стимулятору. которые также имеют головку Bob на PTZ, но устойчивы к альде карбюратору. Кроме того, следует понимать, что ингибирующие мутанты ГАМК возглавляют Боба на PTZ, в то время как черви, у которых отсутствует негативная регуляция холинергической передачи, проявляются диким типом на PTZ.

Таким образом, PTZ-анализ также может быть использован для различения этих классов мутантов синаптической передачи, которые обладают гиперчувствительностью к углеводу Alde. Таким образом, комплементарный подход с PTZ и анализами углеводов Альде должен позволить экспериментатору охарактеризовать мутантов синаптической передачи C таким образом, который невозможен при использовании любого из этих препаратов по отдельности. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.