Скрининг на агрегации амилоида по Полу-денатурирующих моюще-электрофореза в агарозном геле

Здравствуйте, я Рэндалл Хоффман, аспирант лаборатории Сьюзан Лайнус кафедры биологии Массачусетского технологического института (MIT). Сегодня я познакомлю вас с методом полуденатурирующего детергентного агарозного гель-электрофореза, или SDD-AGE. В нашей лаборатории этот метод используется для скрининга прионов и других амилоидогенных белков.

Наша версия определения возраста по SDD проста, надежна и может быть масштабирована для любого количества образцов. Амилоиды исключительно устойчивы к денатурации с помощью SDS, что позволяет отделять их от других белков с помощью SDDH. Однако данные SDDH сами по себе не могут быть использованы для подтверждения того, что вещество является амилоидом.

Для этого необходимо использовать другие методы. Исходя из этого, позвольте мне продемонстрировать. S-D-D-H-S-D-D-H можно выполнить с использованием стандартного оборудования для горизонтального электрофореза ДНК.

Сначала необходимо собрать лоток для отливки геля. Размер аппарата зависит от количества имеющихся образцов. При большом количестве образцов используется плита размером 20 на 24 сантиметра и до четырех гребенков на 50 лунок каждая.

Для приготовления геля вам понадобятся agarose низкой электроэндосмотической подвижности (low EEO) средней или высокой плотности, 1X TAE буфер и 10% стоковый раствор SDS. Приготовьте 1,5% раствор agarose в 1X TAE буфере. Рекомендуется делать гель максимально толстым, чтобы можно было внести наибольший объем образца и максимизировать эффективность детекции. Нагревайте смесь в микроволновой печи до полного растворения agarose.

Быстро добавьте 100 XSDS сток-раствор к 0,1% и перемешайте круговыми движениями. Если на этом этапе какая-либо часть препарата затвердеет, растворите её на плитке. Будьте осторожны, чтобы раствор не закипел.

После добавления SDS раствор может легко вспениться, поэтому перелейте его в форму для литья, пока он еще горячий. Затем с помощью гребенки удалите все пузырьки воздуха, которые могут помешать в дальнейшем при переносе геля. После полного охлаждения и затвердевания геля осторожно извлеките гребенки и поместите гель в кювету.

Полностью погрузите гель в буфер XTAE с 0,1% SDS. Теперь можно приступать к нанесению образцов. Образцы белков, используемые в SDDH, готовят так же, как и для SDS-PAGE, за двумя важными исключениями.

Во-первых, следует избегать нагревания образцов, так как это может привести к денатурации агрегатов в белковые мономеры. Во-вторых, необходимо принять меры для предотвращения деградации белков. Поскольку используемые здесь денатурирующие условия недостаточны для инактивации всех протеаз, мы рекомендуем использовать не менее чем двукратную рекомендуемую концентрацию полного коктейля ингибиторов протеаз.

В данной демонстрации мы будем использовать лизаты клеток дрожжей, в которых сверхэкспрессирован определенный интересующий нас белок. Обычно мы используем две мл overnight-культуры, выращенные в 96-луночных планшетах от VWR, однако при анализе белков с низкой экспрессией необходимо использовать бóльшие объемы культур.

Соберите клетки, центрифугируя культуру при 2000 RCF в течение пяти минут при комнатной температуре; после центрифугирования удалите супернатант и промойте клетки, ресуспендировав их в воде и повторно центрифугировав. После второго осаждения удалите супернатант и ресуспендируйте клетки в соответствующем растворе для посева. Энзимы в растворе переваривают клеточные стенки, что позволит эффективно лизировать клетки с помощью небольшого объема буфера для лизиса. Инкубируйте в течение 30 минут при 30 °C.

Осадите оставшиеся пластиковые ячейки путем центрифугирования при 800 RCF в течение пяти минут. Полностью удалите супернатант и ресуспендируйте каждый осадок в 100 µL лизирующего буфера. Затем заклейте блок лентой и перемешайте на вортексе на высокой скорости в течение двух минут.

Это позволяет осадить все пластиковые сферы вместе с клеточным дебрисом при 4 000 RCF в течение двух минут. Осторожно перенесите супернатант в 96-луночный ПЦР-планшет.

Как правило, в нашей лаборатории мы анализируем сотни образцов одновременно, поэтому для облегчения этого процесса используется система автоматического дозирования жидкостей. При необходимости определите концентрацию белка в лизатах. Затем добавьте в образцы 4x буфер для образцов, чтобы получить лизаты с концентрацией буфера 1x, и инкубируйте в течение пяти минут при комнатной температуре.

Теперь внесите образцы в гель. При необходимости сохраните половину образцов для анализа методом SDS-PAGE. Также внесите маркеры молекулярной массы, включая предварительно окрашенные маркеры и маркер с очень высокой молекулярной массой, такой как экстракт флектора курицы.

При необходимости важно поддерживать гель в охлажденном состоянии, чтобы предотвратить диффузию низкомолекулярных белков, поэтому электрофорез рекомендуется проводить в холодильной камере. Проводите электрофорез при низком напряжении — менее трех вольт на сантиметр длины геля. Продолжайте электрофорез в течение нескольких часов, пока фронт красителя не достигнет отметки примерно в одном сантиметре от конца геля.

Поскольку амилоид не денатурирует в 2% SDS при комнатной температуре, он остается целостным, в то время как другие комплексы, включая большинство неамилоидных агрегатов, диссоциируют в присутствии 2% SDS. Таким образом, большинство белков будут находиться в мономерной форме и быстро пройдут через гель, тогда как устойчивые к SDS высокомолекулярные амилоиды будут мигрировать медленнее.

После этого гель будет готов к переносу. Хотя можно использовать несколько методов переноса, наилучшие результаты мы получаем при использовании капиллярного переноса. Поскольку капиллярный перенос позволяет работать с гелями любого размера, он удобен для анализа сотен образцов.

Стопка сухой фильтровальной бумаги служит для отвода буфера через гель, в результате чего белки осаждаются на нитроцеллюлозную мембрану, помещенную между бумагой и гелем. Вам потребуется вырезать кусок нитроцеллюлозы, например high bond C, extra, по размеру геля. Также необходимо вырезать 20 листов фильтровальной бумаги GBO 04 и 8 листов фильтровальной бумаги GBO 02 того же размера, что и гель.

GB 04 очень плотный и гигроскопичный. В то же время GB 02 гораздо тоньше и имеет более мелкопористую текстуру, что обеспечивает более равномерный контакт с мембраной. Вырежьте дополнительный фрагмент GB 04 для использования в качестве фитиля, который должен быть примерно на 20 сантиметров шире, чем погруженный в него гель.

Поместите азотный UL WIC, четыре фрагмента GBO oh two и один XTBS в пластиковый контейнер; сформируйте стопку из бумаги в следующем порядке: 20 фрагментов сухого GBO oh four, затем четыре фрагмента сухого GBO oh two и, наконец, один фрагмент предварительно увлажненного GBO oh two.

Положите нитроцеллюлозную мембрану поверх этой стопки. Кратковременно промойте гель на литейной форме водой, чтобы удалить излишки электрофоретического буфера. Затем осторожно начните перемещать гель с формы на стопку, при необходимости смачивая мембрану буфером TBS по мере сдвигания геля с формы.

Избыток буфера помогает предотвратить попадание пузырьков воздуха в гель. Переносная пипетка хорошо подходит для этой цели после того, как гель будет полностью перемещен в кассету. Тщательно проверьте наличие пузырьков воздуха, если таковые имеются.

Приподнимите край геля и снова добавьте буфер, пока не удастся вытеснить пузырьки воздуха. Поместите остальные три предварительно увлажненные полоски GBO на поверхность геля. Обеспечьте плотный контакт между всеми слоями, аккуратно прокатив наконечник пипетки по всей поверхности стопки.

Поместите по обеим сторонам стека для переноса две приподнятые лотки с TBS, накрыв стек предварительно смоченным фитилем так, чтобы оба его конца были погружены в раствор. Накройте собранный стек для переноса дополнительным пластиковым лотком, используя в качестве груза, например, бутылку с водой объемом 500 мл. Фитиль будет забирать буфер из лотков, а сухие фильтровальные бумаги будут обеспечивать движение буфера через гель в течение нескольких часов.

Это позволит осадить белки на мембране; дайте переносу протекать минимум три часа или в течение ночи. После завершения капиллярного переноса мембрану можно обработать стандартным методом вестерн-блоттинга. Здесь представлен типичный блот белков, которые сверхэкспрессировались в штамме дрожжей, предрасполагающем определенные белки к образованию амилоида.

Четко видно, что некоторые из наших кандидатов очень хорошо образуют амилоиды или высокомолекулярные SDS-резистентные формы, как показано здесь и здесь. Другие же не образуют агрегатов и остаются полностью мономерными, как в этих и этих случаях. Кроме того, видно, что размер амилоидных полимеров различается в зависимости от белка, что заметно в этих двух дорожках.

Мы только что продемонстрировали вам простой метод анализа высокомолекулярных нерастворимых агрегатов, таких как амилоиды белков-кандидатов в прионы. Надеемся, что просмотр нашей презентации был для вас интересным и эта методика окажется полезной в исследованиях иммуногенных белков амилоидов. Благодарим за внимание и желаем успехов в ваших исследованияниях.