Скрининг на агрегации амилоида по Полу-денатурирующих моюще-электрофореза в агарозном геле

Здравствуйте, я Рэндалл Хоффман, аспирант лаборатории Сьюзан Лайнус на биологическом факультете Массачусетского технологического института. Сегодня я собираюсь познакомить вас с полуденатурирующим моющим средством агро роза, гелевым электрофорезом или SDD age. Наша лаборатория использует этот метод для скрининга прионов и других арогенных белков.

Наша версия SDD age проста и надежна и может быть масштабирована для размещения любого количества образцов. Амилоиды исключительно устойчивы к денатурации с помощью SDS, что позволяет отделять их от других белков с помощью SDDH. Тем не менее, данные SDDH сами по себе не могут быть использованы для подтверждения того, что что-то является амилоидом.

Для этого нужно использовать другие методики. Имея это в виду, позвольте мне показать вам. S-D-D-H-S-D-D-H может быть выполнен с использованием стандартного оборудования для горизонтального электрофореза ДНК.

Для начала нужно собрать лоток для литья геля. Размер аппарата будет зависеть от того, сколько образцов у вас есть. Для большого количества образцов мы используем плиту 20 на 24 сантиметра, и до четырех гребней на 50 лунок.

Для приготовления геля вам понадобится геле средней или высокой прочности low, EEO agros, один буфер XTAE и 10% исходный раствор SDS. Сделайте 1,5% раствор AROS и один XTAE. Вы захотите сделать гель как можно гуще, чтобы вы могли загрузить как можно больше образца и максимизировать обнаружение. Нагрейте смесь в микроволновой печи до полного растворения арос.

Быстро добавьте 100 XSDS на 0,1% и перемешайте. Если какое-то агро застынет на этом этапе, покраснейте, разведите его на горячей плите. Будьте осторожны, чтобы не дать ему закипеть.

После добавления SDS, так как раствор будет легко пузыриться, вылейте этот раствор в лоток для литья, пока он еще горячий. Затем используйте расческу, чтобы избавиться от пузырьков, которые могут помешать позже во время переноса геля. После того как гель полностью остынет и застынет, осторожно снимите расчески и поместите гель в емкость.

Полностью погрузите гель в одну XTAE с 0,1% SDS. Теперь вы готовы к загрузке образцов. Образцы белка, используемые в SDDH, готовятся так же, как и на странице SDS, за двумя важными исключениями.

Во-первых, следует избегать нагрева образцов, который может привести к денатурации агрегатов в белковые мономеры. Во-вторых, следите за тем, чтобы не допустить расщепления белка. Поскольку используемые здесь условия денатурации недостаточны для инактивации всех протеаз, мы рекомендуем использовать концентрацию, по крайней мере, в два раза превышающую рекомендуемую концентрацию полного коктейля ингибиторов протеазы.

В этой демонстрации мы будем использовать лизаты дрожжевых клеток, которые чрезмерно экспрессируют определенный интересующий нас белок. Обычно мы используем два мила на ночь. Культуры, выращенные в 96, хорошо доступны блоки из ВВР, но при анализе белков низкой распространенности необходимо использовать большие объемы культуры.

После центрифугирования соберите клетки путем центрифугирования культуры при температуре 2000 RCF в течение пяти минут при комнатной температуре, после центрифугирования удалите наднатант и промойте клетки суспензией Resus в воде и снова центрифугируя после второго отжима, удалите надосадочную жидкость и смолу клеток в запасном растворе для покрытия. Содержащиеся в растворе zy переваривают клеточные стенки, что позволит вам эффективно обрабатывать клетки и небольшой объем лизисного буфера. Выдерживать в течение 30 минут при температуре 30 градусов Цельсия.

Обваляйте запасные пластиковые элементы на этот раз при 800 RCF в течение пяти минут. Полностью удалите сат и повторно суспендируйте каждую гранулу и 100 микролитров буфера для лизиса. Далее накрываем блок скотчем и вортексем на высокой скорости в течение двух минут.

Это помогает всем сферическим пластикам LY P выводить клеточный мусор при 4000 RCF. На две минуты. Осторожно перенесите Snatin в 96-луночный ПЦР-планшет.

Как правило, в нашей лаборатории мы анализируем сотни образцов за раз, поэтому в этом нам помогает система работы с жидкостями. При желании определите концентрацию белка в лизатах. Затем добавьте четыре x буфера для образцов к образцам для получения лизатов, содержащих один x буфер для образцов, инкубируйте в течение пяти минут при комнатной температуре.

Теперь загрузите образцы в гель. При желании сохраните половину образцов для анализа страницы SDS. Кроме того, загрузите маркеры молекулярной массы, в том числе предварительно окрашенные маркеры и маркеры с очень высокой молекулярной массой, такие как экстракт куриного флектора.

При желании важно держать гель в прохладном месте, чтобы предотвратить диффузию низкомолекулярных белков, поэтому вы можете запустить его в холодную комнату. Запустите гель при низком напряжении менее трех вольт на сантиметр длины геля. Запускайте гель в течение нескольких часов, пока диаметр не достигнет примерно одного сантиметра от конца геля.

Поскольку амилоид не денатурируется 2%SDS при комнатной температуре, он останется неповрежденным, в то время как другие комплексы, включая большинство неамилоидных агрегатов, диссоциируют в присутствии 2%SDS. Таким образом, большинство белков будут мономерными и быстро проходить через гель. В то время как устойчивые к SDS высокомолекулярные амилоиды будут мигрировать медленнее.

После этого гель будет готов к переносу. Несмотря на то, что можно использовать несколько методов переноса, наилучшие результаты мы получаем при использовании капиллярного переноса. Поскольку капиллярный перенос может вместить гель любого размера, целесообразно анализировать сотни образцов при капиллярном переносе.

Стопка сухой промокательной бумаги действует как буфер через гель, откладывая белки на нитроцеллюлозную мембрану, расположенную между бумагой и гелем. Вам нужно будет вырезать кусок нитроцеллюлозы, например, с высокой связностью C, дополнительно до тех же размеров, что и гель. Вам также нужно будет отрезать 20 штук промокательной бумаги GBO ох четыре и восемь штук промокательной бумаги до того же размера, что и гель.

GB oh four очень густой и впитывающий. В то время как GBO oh two намного тоньше и имеет более тонкую текстуру, что обеспечивает более равномерный контакт с мембраной. Отрежьте дополнительный кусок GBO oh four для использования в качестве фитиля и сделайте его примерно на 20 сантиметров шире погруженного геля.

Из закиси азота UL WIC и четырех штук GBO Oh two and one XTBS в пластиковый контейнер собираем стопку бумаг следующим образом, 20 штук сухих GBO oh four. Потом четыре штуки сухого ГБО ой два. Потом один кусочек предварительно смоченного ГБО ой два.

Сверху на эту стопку выложите нитроцеллюлозу. Кратковременно промойте гель на литейном поддоне в воде, чтобы удалить излишки рабочего буфера. Затем осторожно начинайте сдвигать гель с лотка на стопку, при этом снимая гель с лотка, наклеивайте мембрану TBS по мере необходимости.

Дополнительный буфер помогает предотвратить попадание пузырьков в гель. Переводная пипетка хорошо подходит для этой цели после того, как гель был полностью перемещен в стопку. Тщательно проверьте, нет ли пузырьков, если они присутствуют.

Поднимите край геля и повторно нанесите буфер до тех пор, пока пузырьки не будут очищены. Выложите оставшиеся три предварительно смоченные ГБО или две штуки сверху на гель. Обеспечьте плотный контакт между всеми слоями, плотно проведя пипеткой по верхней части стопки.

По бокам передаточной стопки с двумя приподнятыми лотками, содержащими TBS, накидывайте предварительно увлажненный фитиль поперек стопки так, чтобы оба конца фитиля были погружены в воду. В TBS накройте собранный передаточный стек дополнительным пластиковым лотком, несущим дополнительный груз, такой как бутылка воды объемом 500 мил. Фитиль будет извлекать буфер из лотков, а сухая промокательная бумага будет протягивать буфер через гель в течение нескольких часов.

Это отложит белки на мембране, что позволит переносу продолжаться в течение как минимум трех часов или в течение ночи. После завершения капиллярного переноса мембрану можно обработать стандартным вестерн-блоттингом. Здесь вы видите типичное пятно белков, которые были чрезмерно экспрессированы в штамме дрожжей, что предрасполагает определенные белки к образованию амилоида.

Вы можете ясно видеть, что некоторые из наших кандидатов образуют амилоид или высокомолекулярные устойчивые к SDS виды очень хорошо, как показано здесь и здесь. Другие, однако, не образуют агрегатов и являются полностью мономерными, как эти и эти. Кроме того, вы можете видеть, что размер полимеров амилоида различается в зависимости от белка, который вы можете увидеть в этих двух полосах.

Мы только что показали вам простой метод анализа высокомолекулярных нерастворимых агрегатов, таких как амилоиды потенциальных прионов. Мы надеемся, что вам понравилось смотреть нашу презентацию и вы нашли эту методику полезной и исследования иммуногенных белков Эми. Спасибо за просмотр и удачи в ваших исследованиях.