Дважды Всего горе на месте гибридизация раннего куриных эмбрионов

Эта процедура начинается с фиксации, обработки метанолом и протеиназой К эмбрионов, за которой следует ночная инкубация с помощью зонда на один дигген или копания и зонда. Два эмбриона флуоресцеина изотиоцианата или ZI инкубируют с антителом DIG после цветовой реакции с щелочной фосфатазой DIG. Активность инактивируется, и эмбрионы инкубируются.

При FSE проводится цветовая реакция антител с Zi и закрепляются эмбрионы. Здравствуйте, я Дельфина из лаборатории Рика Финнела в Центре экологической и геномной медицины Техасского университета в Хьюстоне. Сегодня мы покажем Вам процедуру проведения двухцветной гибридизации на месте у куриного эмбриона.

Мы используем эту процедуру в лаборатории для анализа влияния противоэпилептических препаратов на желудочные и нейронные гены. Итак, давайте начнем Чтобы выполнить гибридизацию in situ на куриных эмбрионах, сначала откройте яйцо, постучав по скорлупе щипцами и удалив кусочки скорлупы. Удалите густой альбумин с помощью щипцов и наклоните желточный мешок грубыми щипцами так, чтобы эмбрион был обращен вверх, используя тонкие ножницы.

Вырежьте квадрат из желточного мешка вокруг зародыша. Извлеките зародыш из желтка ложкой и поместите в посуду со льдом. Холодный дей PBS под диссекционным микроскопом Осторожно удалите мембраны и илк и перенесите эмбрион в свежую посуду, содержащую лед.

Холодный дей PBS удерживает эмбрион с помощью щипцов и аспирирует дей PBS в вытяжном шкафу. Замените его на 4%-ный параформный альдегид в ПБС и дайте эмбриону закрепиться при температуре четыре градуса Цельсия на ночь. После того, как эмбрионы будут закреплены, отсадите фиксирующий раствор и утилизируйте его как химические отходы.

Наполните посуду ледяным деем PBS с помощью микрокапиллярной иглы с тупым концом или ножа для микродиссекции, пронзайте голову и сердечные полости. Для предотвращения защемления зонда. Поместите эмбрионы в DEP CPBS, содержащий 0,1% tween 20, затем обезвожьте эмбрионы в серии метанолов в течение 10 минут каждый в 25% 50% 75% и 100% метанол в PBT.

Повторите промывку из 100% метанола. Теперь эмбрионы могут храниться при температуре минус 20 градусов Цельсия в метаноле. В 20 миллилитровых стеклянных сцинтилляционных флаконах.

Чтобы провести гибридизацию insitu, необходимо сначала провести регидратацию эмбрионов. Для этого промойте эмбрионы по 10 минут каждый в 75% 50% и 25% метанола в PBT. Наконец, постирайте дважды по 10 минут каждый.

При ПБТ удалите раствор ПБТ из флаконов и замените его раствором протеинады К в количестве пяти микрограммов на миллилитр. Три миллилитра на флакон. Аккуратно сверните флакон, чтобы убедиться, что все содержимое подверглось воздействию раствора протеиназы К.

Оставьте в растворе протеиназы К на одну-пять минут в зависимости от стадии эмбриона. Тем временем приготовьте ледяной фиксирующий раствор с помощью пипетки без РНК, удалите раствор протеиназы К и добавьте два миллилитра фиксирующего раствора. Сразу же поместите флакон на лед ровно на 20 минут.

Далее промойте эмбрионы при комнатной температуре на мутаторе. Выполните две 10-минутные промывки в PBT, а затем одну 10-минутную промывку в 50% буфере гибридизации в PBT. Затем промойте один раз в 100% буфере для гибридизации, инкубируйте эмбрионы в двух миллилитрах гибридизационного буфера в течение четырех-пяти часов.

При 65 градусах по Цельсию. Теперь эмбрионы готовы к гибридизации с помощью зондов dig и синтеза фитзи сопряженных зондов описан в вспомогательном материале. Зонд, который, как ожидается, будет давать сильный сигнал, должен быть синтезирован с помощью нуклеотидов, содержащих FSE, в то время как более слабые зонды должны быть синтезированы с помощью нуклеотидов, содержащих DIG.

Предварительно предупредите зонды в буфере для гибридизации с помощью двухмиллилитрового флакона. Удалите буфер для гибридизации из эмбрионов и немедленно замените буфер для гибридизации раствором зонда. Важно не давать эмбрионам высохнуть в течение 16 часов при температуре 65 градусов Цельсия.

После этапа гибридизации зонда замените раствор зонда буфером для гибридизации. Выполните два 30-минутных мытья при температуре 65 градусов Цельсия, затем мойтесь в течение 15 минут в смеси гибридизации, буфера и буфера малеиновой кислоты один к одному при температуре 65 градусов Цельсия. После этого шага вам больше не нужно использовать условия без РНК.

Теперь вы готовы выполнить реакцию цвета копания, за которой последует реакция цвета Фитца. Чтобы сначала провести гибридизацию антител и цветовую реакцию, промойте эмбрионы дважды по 20 минут каждый в буфере малеиновой кислоты. Затем постирайте в течение часа в 2% VBR в буфере малеиновой кислоты.

Наконец, понаблюдайте в течение пяти часов в блокирующем буфере, разбавьте антитело от одного до 2000 в блокирующем буфере и инкубируйте эмбрионы в этом растворе на мутаторе в течение ночи при четырех градусах Цельсия. На следующий день выполните три 10-минутных полоскания в буфере малеиновой кислоты, а затем три одночасовых полоскания в буфере малеиновой кислоты. Постирайте дважды по 20 минут каждый.

В НТМТ добавляют 200 микролитров субстрата N-B-T-B-C-I-P на 10 миллилитров. NTMT немедленно извлекают NTMT из флакона с эмбрионом и заменяют на один-два миллилитра. N-B-T-B-C-I-P буферное место в темноте.

Следите за цветовой реакцией через 20 минут и с интервалом в 20 минут после этого. Когда голубой цвет разовьется соответствующе, промойте эмбрионы в PBS в течение 10 минут. Затем замените PBS на 4%-ный параформный альдегид в PBS.

Зафиксируйте на ночь при температуре четыре градуса по Цельсию. Перенесите эмбрион в новую установочную пробирку в PBT дважды по 10 минут каждая, после чего последует два 10-минутных промывки в буфере малеиновой кислоты. Инкубируйте эмбрионы в буфере с малеиновой кислотой в течение 30 минут при температуре 65 градусов Цельсия.

Теперь пришло время провести вторую инкубацию антител и цветовую реакцию. Для того, чтобы обнаружить наш второй зонд, промывайте эмбрионы дважды по 10 минут каждый в буфере малеиновой кислоты. Один час в 2% BBR в буфере малеиновой кислоты.

Затем через пять часов в блокирующем буфере развести щелочное антитело, связанное с фосфатазой, один к 500 в блокирующем буфере и инкубировать эмбрионы в этом растворе в течение ночи при четырех градусах Цельсия. На следующее утро было проведено три 10-минутных промывания в буфере малеиновой кислоты, за которыми последовали три одночасовых промывания в буфере малеиновой кислоты. Далее умывайтесь дважды по 20 минут каждый.

В Tris HCL приготовьте пять миллилитров векторного красного рабочего раствора в Tris HCL в соответствии с протоколом производителя. Немедленно извлеките трисс HCL из флакона и замените его векторным красным буфером. Поместите флаконы в темноту.

Следите за цветовой реакцией через 30 минут и через 30 минут после этого, после того как развился красный цвет, перенесите эмбрионы в PBS. Вы наконец-то готовы к фиксации и обработке эмбрионов. Переложите их в фиксирующую чашку, содержащую 4% параформа, альдегид и зафиксируйте на 20 минут при комнатной температуре или на ночь при температуре четыре градуса Цельсия.

Стирайте дважды в PBS по 10 минут за промывку, чтобы обработать для фотосъемки. Перенесите эмбрионы на 20% глицерин в PBS. Это сделает эмбрионы полупрозрачными для процесса среза воска.

Перенесите эмбрионы обратно в PBS, промойте дважды по 10 минут, каждый раз обезвоживайте в серии метанола по 10 минут, замените метанол на пропанол и инкубируйте в течение трех минут. Удалите пропанол и замените на 1 2 3 4 tetra hydro nap filine на 20 минут, после чего нанесите histo clear, два мытья по одному часу каждое. Замените смесь гистопрозрачного лака и воска один к одному и выдерживайте при температуре 60 градусов Цельсия в течение одного часа.

Замените этот раствор воском и проведите процесс для гистологии. Этот эмбрион помечен кислородом digo в носках, двумя зондами синего цвета и зондом fitzy delta one, который отображается красным цветом. Первая цветовая реакция выявляет мимический рисунок носков. Два.

Маркер для нервной пластинки, разработанный в лаборатории доктора Робина, две положительные клетки появляются синим цветом после реакции с N-B-T-B-C-I-P. Затем тот же эмбрион обрабатывается для второй цветовой реакции, которая выявляет паттерн экспрессии дельта-один. Маркер для сегментарной пластины, разработанный в лаборатории доктора Доминго Энрике Дельта, является одним положительным клетением, появляющимся красным цветом после реакции с красным вектором.

Этот эмбрион помечен диго в PAC six зондом синего цвета и фитзи зондом SHH красным цветом. Первая цветовая реакция показывает паттерн экспрессии PAC six, маркера для нейронных складок и развивающихся сомитов, разработанного в лаборатории доктора Мартина Гулдинга Pac. Шесть положительных клеток выглядят синими после реакции с N-B-T-B-C-I-P.

Вторая цветовая реакция выявляет паттерн экспрессии маркера SHHA для Noor и вентральной средней линии нервной трубки, разработанного в лаборатории доктора Клиффа Таббана. SHH-положительные клетки появляются красными после реакции с векторным красным. Мы только что показали вам, как проводить цветовую и с-гибридизацию в курином хозяйстве.

При выполнении этой процедуры важно помнить об использовании растворов, обработанных глубиной С, а также автоклав, пфас и стерильный vi. Для того чтобы свести к минимуму контакт с РНК есть шаги с третьего по пятый. Вот и все.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.