Reaggregate Thymus культур

Здравствуйте, меня зовут Андреа Уайт, я из лаборатории Грэма Андерсона и Эрика Дженкинсона в Центре иммунной регуляции MRC при Бирмингемском университете. Сегодня я представляю протокол получения реагрегированных культур органов тимуса, который может быть использован для изучения сложных клеточных взаимодействий, происходящих во время дифференцировки Т-клеток. Перед началом этой процедуры эмбриональные доли тимуса были изолированы и обработаны для удаления всех лимфоцитов.

Это можно увидеть на отдельном видео. Затем алиеноидные доли дезагрегируются для получения препарата стромальных клеток. И, наконец, клетки агрегируются с образованием реагрегированной культуры fmic-органов.

Давайте начнем. После пяти-семи дней культивирования LO должен быть готов к дезагрегированию для препаратов shoal cell погрузите фильтры 0,8 микрометра в чашку Петри, содержащую RPMI 1640 плюс 10% FCS С помощью щипцов осторожно оттолкните любые откосы волокон, которые не всплывают. Используйте один мил для каждого питомца, чтобы перенести доли в 1,5 мил орфяной трубки.

Мы рекомендуем не более 50 долей на одну пробирку. Дайте лопастям осесть на дно пробирки под действием силы тяжести и удалите среду. Промойте доли одним милом PBS, а затем дайте доле снова опуститься на дно.

Повторите это в общей сложности для трех стирок PBS, удалите последнюю промывку PBS и добавьте 600 микролитров 0,25%-ного трипса в раствор. Поместите трубку эйнора в инкубатор с температурой 37 градусов на 25 минут. Аккуратно тритируйте доли с помощью синего наконечника в один мил на перпете в течение 10 секунд, а затем поместите обратно в инкубатор через 20 минут, пипетируйте доли вверх и вниз, чтобы полностью дезагрегировать их.

Это должно занять около 30 секунд Чтобы получить суспензию одной клетки, добавьте 400 микролитров ледяного холода, RPMI 1640 плюс 10% FCS для нейтрализации трипсина имп гранулы клеток путем центрифугирования при тысяче оборотов в минуту, 10 минут при четырех градусах Цельсия, удалите суп и повторно суспендируйте гранулу в одном миле. RPMI 1640 плюс 10% FCS при желании. Подсчитайте ячейки.

Как правило, мы ожидаем около 50 000 клеток на долю диоксазина, начиная с волокнистого Е15. Теперь мы готовы к формированию агрегатных культур fmic Corgan в полуторатысячной орфя-трубке. Смешанные, свежеприготовленные мелкие стромальные клетки.

Вместе с предварительно отобранными CD четыре положительных CD восемь положительных фиброцитов. Мы рекомендуем соотношение стромальных клеток и фиброцитов примерно один к одному. Количество ячеек, которые вы будете использовать, будет зависеть от количества доступных клеток и проводимых экспериментов.

Мы рекомендуем не менее ста тысяч ячеек в общей сложности и не более 1,5 миллионов ячеек. Вы хотите, чтобы V-образные агрегаты были достаточно большими, чтобы их можно было воспроизвести, но не настолько большими, чтобы центр мог умирать от пеллетных ячеек путем центрифугирования при тысяче оборотов в минуту в течение 10 минут. При четырех градусах С тщательно соберите фильтр для культуры органов.

Удалите все SUP-натин поэтапно с помощью P 200 на питомца. Вихревую ячейку гранул в течение 10 секунд до образования суспензии. Объем должен составлять около одного-двух микролитров рта.

Влейте кашицу в тонко протянутое домашнее животное, сохраняя суспензию клеток на кончике питомца. Под нашим препарирующим микроскопом осторожно нанесите ПЭТ клеточную суспензию на центр фильтра 0,8 микрометра. В идеале клетки должны располагаться в виде стоячей капли в круге диаметром один-два миллиметра.

Если суспензия начинает растекаться, дайте жидкости в суспензии стечь через пос, прежде чем откладывать оставшиеся клетки. Поместите блюдо в пластиковую коробку для бутербродов и закройте. Что касается культур органов тимуса, и помещаем коробку в инкубатор, мы агрегируем формы культур в неповрежденные структуры в течение 18 часов после культивирования.

После четырех-пяти дней культивирования они будут генерировать как CD четыре положительные восемь отрицательных, так и CD четыре отрицательных восьми положительных субпопуляции зрелых цитов. Начиная с 50 обработанных диоксазином долей, они должны дать достаточное количество стромальных клеток для приготовления трех-пяти реагрегированных культур. Эти культуры обычно выглядят как когерентные кучи клеток, которые можно оттолкнуть от фильтров с помощью щипцов, не разрушая их.

Мы только что описали метод, с помощью которого можно изучать положительный отбор эпителиальными клетками F. Этот метод также может быть использован для изучения отрицательного отбора, опосредованного дендритными клетками. Наконец, с использованием трансгенных фиброцитов TCR или дефицитных стромальных клеток MHC класса один или MHC класса два.

Эта система позволяет проводить отдельные исследования по отбору CD 4 или CD 8 положительных Т-клеток. Спасибо, что настроились.