Name: Reaggregate Thymus культур (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Изучите метод получения реагрегатных культур тимуса для исследования дифференцировки Т-клеток и клеточных взаимодействий. Этот протокол позволяет генерировать субпопуляции CD4+ и CD8+ Т-клеток.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Более подробную информацию о подготовке reggregate тимуса культур пожалуйста, посетите <a href="http://www.springerprotocols.com/">Springer протоколы</a> .

Авторы не заявляют о наличии конфликта интересов.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/905/">Reaggregate Thymus Cultures.</a> A revised abstract was republished due to a publisher error. The abstract was corrected to:
Stromal cells within lymphoid tissues are organized into three-dimensional structures that provide a scaffold that is thought to control the migration and development of haemopoeitic cells. Importantly, the maintenance of this three-dimensional organization appears to be critical for normal stromal cell function, with two-dimensional monolayer cultures often being shown to be capable of supporting only individual fragments of lymphoid tissue function. In the thymus, complex networks of cortical and medullary epithelial cells act as a framework that controls the recruitment, proliferation, differentiation and survival of lymphoid progenitors as they undergo the multi-stage process of intrathymic T-cell development. Understanding the functional role of individual stromal compartments in the thymus is essential in determining how the thymus imposes self/non-self discrimination. Here we describe a technique in which we exploit the plasticity of fetal tissues to re-associate into intact three-dimensional structures in vitro, following their enzymatic disaggregation. The dissociation of fetal thymus lobes into heterogeneous cellular mixtures, followed by their separation into individual cellular components, is then combined with the in vitro re-association of these desired cell types into three-dimensional reaggregate structures at defined ratios, thereby providing an opportunity to investigate particular aspects of T-cell development under defined cellular conditions. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).
from 
In the thymus, immature CD4+8+ thymocytes expressing randomly rearranged T-cell receptor &alpha;- and b-chain genes undergo positive and negative selection events based on their ability to recognize self-peptide/major histocompatibility complex (MHC) molecules expressed by thymic stromal cells. In vivo analysis of the role of thymic stromal cells during intrathymic selection is made difficult by the cellular complexity of the thymic microenvironment in the steady-state adult thymus, and by the lack of appropriate targeting strategies to manipulate gene expression in particular thymic stromal compartments. We have shown that the thymic microenvironment can be readily manipulated in vitro through the use of reaggregate thymus organ cultures, which allow the preparation of three-dimensional thymus lobes from defined stromal and lymphoid cells. Although other in vitro systems support some aspects of T-cell development, reaggregate thymus organ culture remains the only in vitro system able to support efficient MHC class I and II-mediated thymocyte selection events, and so can be used as an effective tool to study the cellular and molecular regulation of positive and negative selection in the thymus.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/905/">Reaggregate Thymus Cultures</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.

Erratum: Reaggregate Thymus Cultures

reaggregate thymus культур

Reaggregate Thymus Cultures

В вилочковой железе, незрелых CD4 +8 + тимоцитов выражения случайно переставить Т-клеточного рецептора α-и бета-цепи генов претерпевают позитивной и негативной селекции событий основано на их способности распознавать self-peptide/major комплекса гистосовместимости (MHC) молекулы выраженное тимуса стромальных клеток. В естественных условиях анализ роли тимуса стромальных клеток при intrathymic выбор затрудняется сотовой сложности тимуса микроокружения в стационарном тимуса взрослого, и из-за отсутствия соответствующей ориентации стратегии манипулировать экспрессии генов, в частности, тимуса стромальных отсеков. Мы показали, что вилочковая микроокружения можно легко манипулировать в пробирке с помощью reaggregate тимуса культур орган, который позволит подготовки трехмерных тимуса долях от определенных стромальных и лимфоидных клеток. Хотя другие в системах пробирке поддержку некоторых аспектов Т-клеточного развития, reaggregate тимуса органной культуры остается только в пробирке система в состоянии поддерживать эффективную MHC класса I и II-опосредованной тимоцитов события выбора, и поэтому может быть использован как эффективный инструмент для изучения клеточной и молекулярной регуляции позитивной и негативной селекции в тимусе.

В этом видео подготовке 2-dGuo обработанных reaggregate тимуса культур продемонстрировали.

Reaggregate Thymus культур

Стромальные клетки в лимфоидных тканях организованы в трехмерные структуры, которые создают каркас, предположительно контролирующий миграцию и...

Здравствуйте, меня зовут Андреа Уайт, я представляю лабораторию Грэма Андерсона и Эрика Дженкинсона в Центре иммунной регуляции MRC при Бирмингемском университете. Сегодня я представлю протокол получения реагрегатных культур тимусных органоидов, которые могут быть использованы для изучения сложных клеточных взаимодействий, происходящих в процессе дифференцировки Т-клеток. Перед началом данной процедуры были выделены эмбриональные доли тимуса и подвергнуты обработке для удаления всех лимфоцитов.Это можно увидеть в отдельном видео. Затем инородные доли подвергаются дезагрегации для получения препарата стромальных клеток. И, наконец, клетки объединяются для создания реагрегированной органной культуры fmic.Приступим. После пяти-семи дней культивирования органоиды печени (LO) должны быть готовы к дезагрегации для приготовления суспензии клеток; погрузите фильтры с порами 0,8 мкм в чашку Петри с RPMI 1640 и 10% FCS. С помощью пинцета осторожно снимите все волокнистые скопления, которые не всплыли сами. Используйте пипетку объемом 1 мл для переноса долек в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.Мы рекомендуем помещать не более 50 долек в одну центрифужную пробирку. Дайте долькам осесть на дно пробирки под действием силы тяжести и удалите среду. Промойте дольки 1 мл PBS, после чего снова дайте им осесть на дно.Повторите эту процедуру до получения в общей сложности трех промывок PBS, удалите последнюю порцию PBS и добавьте 600 µL 0,25% раствора трипсина. Поместите пробирку Эппендорфа в инкубатор при 37 °C на 25 минут. Осторожно тритурируйте доли, используя синий наконечник объемом 1 мл и дозатор, в течение 10 секунд, затем верните пробирку в инкубатор; через 20 минут несколько раз пропустите доли через наконечник пипетки до их полной диссоциации.Для получения суспензии из отдельных клеток добавьте 400 µL ледяного среды RPMI 1640 с 10% FCS, чтобы нейтрализовать трипсин. Осадите клетки центрифугированием при 1000 RPM в течение 10 минут при 4 °C, удалите супернатант и, при необходимости, ресуспендируйте осадок в 1 мл среды RPMI 1640 с 10% FCS. Подсчитайте количество клеток.Обычно мы ожидаем около 50 000 клеток на одну долю диоксазина, начиная с эмбриона 15-го дня (E 15 fibrous). Теперь мы готовы сформировать агрегаты культур fmic Corgan в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл. Смешайте свежеприготовленные стромальные клетки.Вместе с предварительно отобранными CD4+ CD8+ фиброцитами. Мы рекомендуем использовать соотношение стромальных клеток и фиброцитов примерно один к одному. Количество используемых клеток будет зависеть от имеющегося числа клеток и проводимых экспериментов.Мы рекомендуем использовать в общей сложности не менее 100 000 клеток и не более 1,5 миллиона клеток. Агрегаты V должны быть достаточно крупными для обеспечения воспроизводимости, но не настолько большими, чтобы клетки в центре погибли. Осадите клетки центрифугированием при 1000 RPM в течение 10 минут при температуре 4 °C, затем аккуратно соберите фильтр для органной культуры.Удалите весь супернатант с осадка с помощью дозатора P 200. Вортексируйте клеточный осадок в течение 10 секунд до образования суспензии. Объем должен составлять примерно 1–2 µL.Перенесите суспензию в тонкостенную пипетку, удерживая взвесь клеток на кончике пипетки. Под бинокулярным микроскопом осторожно нанесите суспензию клеток в центр фильтра с порами 0.8 µm. В идеале клетки должны быть размещены в виде стоячей капли в круге диаметром от одного до двух миллиметров.Если суспензия начнет растекаться, дайте жидкости из суспензии стечь через пористый фильтр перед тем, как выложить оставшиеся клетки. Поместите чашку в пластиковый контейнер-консерватор и герметично закройте. Как и в случае с культурами органов тимуса, поместите контейнер в инкубатор; агрегаты в культурах формируются в целостные структуры в течение 18 часов культивирования.После четырех-пяти дней культивирования образуются как зрелые субпопуляции цитокинов CD4+CD8-, так и CD4-CD8+. Использование 50 обработанных диоксазином долей должно обеспечить достаточное количество стромальных клеток для подготовки трех-пяти культур реагрегатов. Эти культуры обычно выглядят как когерентные скопления клеток, которые можно сдвинуть с фильтров с помощью пинцета, не нарушая их целостности.Мы только что описали метод изучения положительного отбора эпителиальными клетками тимуса. Этот метод также может быть использован для изучения негативного отбора, опосредованного дендритными клетками. Наконец, метод применим при использовании ТCR-трансгенных ФИБРОЦИТОВ или стромальных клеток с дефицитом MHC I класса или MHC II класса.Эта система позволяет проводить раздельные исследования селекции CD4-положительных или CD8-положительных Т-клеток. Спасибо за внимание.

Research

JoVE Journal

Biology

Биология

В этом видеоролике показано вскрытие и удаление вилочковой железы плода, а также подготовку бывших культур естественных условиях от 2-dGuo обработанных тимуса.

Получение 2-dGuo обработанных Thymus культур Органный

Это видео демонстрирует протокол для генерации функциональных антиген-специфичных Т-клеток из незрелых Т-клеток, полученных из iPSC, с использованием трехмерной системы культивирования тимуса. Совместное культивирование незрелых Т-клеток, полученных из iPSC, с долями тимуса плода плода мышей, истощенных эндогенными лимфоцитами, привело к успешному созреванию Т-клеток с образованием тимусовых эмигрантов (iTEs), полученных из CD8αβ+ MHC класса I+ iPSC.

Трехмерная культуральная система тимуса для получения тимусовых эмигрантов, полученных из ИПСК

Этот протокол детали способа, чтобы изолировать антиген представляющих клеток из человеческого тимуса через различные этапы ферментативного расщепления ткани с последующим плотности центрифугированием суспензии отдельных клеток и, наконец, магнитного и / или сортировки FACS клеточных популяций, представляющих интерес.

Изоляция миелоидных дендритных клеток и эпителиальных клеток из человеческого тимуса

Здесь мы опишем эффективный метод изоляции, идентификации и очистки мыши тимуса эпителиальных клеток (ТИК). Протокол может быть использован для изучения функции тимуса для нормального развития Т-клеток тимуса, дисфункции и восстановления Т-клеток.

Выделение, идентификация, и очистка мышиного тимуса эпителиальных клеток

Изучение медуллярных эпителиальных клеток тимуса in vitro было в значительной степени неудачным, поскольку современные системы 2D-культивирования не имитируют сценарий in vivo. Описанная здесь 3D-система культивирования - модифицированная модель органотипической культуры кожи - доказала свое превосходство в повторении пролиферации mTEC, дифференцировке и поддержании неразборчивой экспрессии генов.

3D Органотипической Совместное культивирование Модель поддержки Медуллярный тимуса эпителиальных клеток пролиферации, дифференцировки и Promiscuous экспрессии генов

В этой статье описывается методология in vivo и in vitro для характеристики предшественников заселения тимуса путем анализа кинетики генерации, фенотипа и количества их потомства Т-клеток.

Характеристика тимуса Поселившись предшественников у эмбрионов мышей, используя<em&gt; В Vivo</em&gt; И<em&gt; In Vitro</em&gt; Анализы

Это видео демонстрирует протокол обогащения эпителиальных клеток тимуса (TEC) градиентом плотности для выделения FACS. В нем также показано использование пептидов EAK16-II/EAKIIH6 для стимулирования образования агрегатов TEC. Микроокружение гидрогеля EAK16-II/EAKIIH6 обеспечивает трехмерную конфигурацию, необходимую для поддержания выживаемости и функционирования ТЭО.

Продвижение 3-D агрегацию FACS Очищенная тимуса эпителиальных клеток с ЕАК 16-II / EAKIIH6 самосборки гидрогеля

Описано получение тимуса срезов, которые, в сочетании с проточной цитометрии, могут быть использованы для моделирования позитивной и негативной селекции развития Т-клеток. Тимуса ломтики также могут быть адаптированы для на месте анализа тимоцитов миграции, локализации и сигнализации с помощью иммунофлуоресценции и двухфотонной микроскопии.

Приготовление и применение Органотипической тимуса срез культуры

В этой статье описывается новый метод для создания опухолевых антигенов-специфических индуцированных плюрипотентных стволовых клеток полученных тимических эмигрантов (iTE) трехмерной (3D) тимской культуры системы. iTE - это однородное подмножество Т-клеток, тесно связанных с наивными Т-клетками с способностью к пролиферации, формированию памяти и подавлению опухолей.

Трехмерная тимическая культурная система для генерации Murine индуцированных Плюрипотентные стволовые клетки полученных Опухолевые антигена конкретных Тимических эмигрантов

Этот протокол описывает выделение двойных отрицательных тимоцитов из тимуса мыши с последующей ретровирусной трансдукцией и совместным культивированием в дельта-подобной 4-экспрессирующей системе совместного культивирования стромальных клеток костного мозга (OP9-DL4) для дальнейшего функционального анализа.

Совместное культивирование и трансдукция мышиных тимоцитов на дельта-подобных 4-экспрессирующих стромальных клетках для изучения онкогенов при Т-клеточном лейкозе

В данной статье мы описываем протокол формирования органоидов тимуса человека, полученных из iPSC, выращенных в 3D-фибриновых гидрогелях с целью поддержки созревания эпителиальных клеток тимуса (TEC) и их длительного поддержания, а также тимопоэза in vitro.

Образование органоидов тимуса человека в трехмерных фибриновых гидрогелях

Изучите метод получения реагрегатных культур тимуса для исследования дифференцировки Т-клеток и клеточных взаимодействий. Этот протокол позволяет генерировать субпопуляции CD4+ и CD8+ Т-клеток.

Reaggregate Thymus культур

Больше видео