Reaggregate Thymus культур

Здравствуйте, меня зовут Андреа Уайт, я представляю лабораторию Грэма Андерсона и Эрика Дженкинсона в Центре иммунной регуляции MRC при Бирмингемском университете. Сегодня я представлю протокол получения реагрегатных культур тимусных органоидов, которые могут быть использованы для изучения сложных клеточных взаимодействий, происходящих в процессе дифференцировки Т-клеток. Перед началом данной процедуры были выделены эмбриональные доли тимуса и подвергнуты обработке для удаления всех лимфоцитов.

Это можно увидеть в отдельном видео. Затем инородные доли подвергаются дезагрегации для получения препарата стромальных клеток. И, наконец, клетки объединяются для создания реагрегированной органной культуры fmic.

Приступим. После пяти-семи дней культивирования органоиды печени (LO) должны быть готовы к дезагрегации для приготовления суспензии клеток; погрузите фильтры с порами 0,8 мкм в чашку Петри с RPMI 1640 и 10% FCS. С помощью пинцета осторожно снимите все волокнистые скопления, которые не всплыли сами. Используйте пипетку объемом 1 мл для переноса долек в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.

Мы рекомендуем помещать не более 50 долек в одну центрифужную пробирку. Дайте долькам осесть на дно пробирки под действием силы тяжести и удалите среду. Промойте дольки 1 мл PBS, после чего снова дайте им осесть на дно.

Повторите эту процедуру до получения в общей сложности трех промывок PBS, удалите последнюю порцию PBS и добавьте 600 µL 0,25% раствора трипсина. Поместите пробирку Эппендорфа в инкубатор при 37 °C на 25 минут. Осторожно тритурируйте доли, используя синий наконечник объемом 1 мл и дозатор, в течение 10 секунд, затем верните пробирку в инкубатор; через 20 минут несколько раз пропустите доли через наконечник пипетки до их полной диссоциации.

Для получения суспензии из отдельных клеток добавьте 400 µL ледяного среды RPMI 1640 с 10% FCS, чтобы нейтрализовать трипсин. Осадите клетки центрифугированием при 1000 RPM в течение 10 минут при 4 °C, удалите супернатант и, при необходимости, ресуспендируйте осадок в 1 мл среды RPMI 1640 с 10% FCS. Подсчитайте количество клеток.

Обычно мы ожидаем около 50 000 клеток на одну долю диоксазина, начиная с эмбриона 15-го дня (E 15 fibrous). Теперь мы готовы сформировать агрегаты культур fmic Corgan в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл. Смешайте свежеприготовленные стромальные клетки.

Вместе с предварительно отобранными CD4+ CD8+ фиброцитами. Мы рекомендуем использовать соотношение стромальных клеток и фиброцитов примерно один к одному. Количество используемых клеток будет зависеть от имеющегося числа клеток и проводимых экспериментов.

Мы рекомендуем использовать в общей сложности не менее 100 000 клеток и не более 1,5 миллиона клеток. Агрегаты V должны быть достаточно крупными для обеспечения воспроизводимости, но не настолько большими, чтобы клетки в центре погибли. Осадите клетки центрифугированием при 1000 RPM в течение 10 минут при температуре 4 °C, затем аккуратно соберите фильтр для органной культуры.

Удалите весь супернатант с осадка с помощью дозатора P 200. Вортексируйте клеточный осадок в течение 10 секунд до образования суспензии. Объем должен составлять примерно 1–2 µL.

Перенесите суспензию в тонкостенную пипетку, удерживая взвесь клеток на кончике пипетки. Под бинокулярным микроскопом осторожно нанесите суспензию клеток в центр фильтра с порами 0.8 µm. В идеале клетки должны быть размещены в виде стоячей капли в круге диаметром от одного до двух миллиметров.

Если суспензия начнет растекаться, дайте жидкости из суспензии стечь через пористый фильтр перед тем, как выложить оставшиеся клетки. Поместите чашку в пластиковый контейнер-консерватор и герметично закройте. Как и в случае с культурами органов тимуса, поместите контейнер в инкубатор; агрегаты в культурах формируются в целостные структуры в течение 18 часов культивирования.

После четырех-пяти дней культивирования образуются как зрелые субпопуляции цитокинов CD4+CD8-, так и CD4-CD8+. Использование 50 обработанных диоксазином долей должно обеспечить достаточное количество стромальных клеток для подготовки трех-пяти культур реагрегатов. Эти культуры обычно выглядят как когерентные скопления клеток, которые можно сдвинуть с фильтров с помощью пинцета, не нарушая их целостности.

Мы только что описали метод изучения положительного отбора эпителиальными клетками тимуса. Этот метод также может быть использован для изучения негативного отбора, опосредованного дендритными клетками. Наконец, метод применим при использовании ТCR-трансгенных ФИБРОЦИТОВ или стромальных клеток с дефицитом MHC I класса или MHC II класса.

Эта система позволяет проводить раздельные исследования селекции CD4-положительных или CD8-положительных Т-клеток. Спасибо за внимание.