Метод полного окрашивания антител горе в Чик
2 февраля 2009 г.
Это видео демонстрирует весь горе иммуногистохимии, метод, которым пространственной и временной экспрессии антигена могут быть визуализированы в молодых куриных эмбрионов. Этот метод впервые был введен Джейн Додд и Том Jessell.
В этом видео продемонстрированы различные этапы проведения иммуногистохимического анализа зародыша курицы в целом с использованием вторичных антител, конъюгированных с HRP. Сначала зародыш фиксируют в параформальдегиде, затем подавляют активность эндогенной пероксидазы.
Затем эмбрион инкубируют с первичными антителами. После нескольких промывок эмбрион инкубируют со вторичными антителами, конъюгированными с HRP. Цветовая реакция проявляется с использованием субстрата DAB, и окрашивание антителами приобретает оранжевый цвет. Преимущество этого метода перед использованием флуоресцентных антител заключается в том, что эмбрионы можно подготовить для заливки в парафин и последующего срезания, что позволяет изучать локализацию антигенов в поперечном сечении.
Здравствуйте, я Дельфина из лаборатории FIN Центра экологической и геномной медицины Университета Texas A&M в Хьюстоне. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру проведения гормонального окрашивания антителами в эмбрионах цыплят с использованием антител, конъюгированных с HRP. Мы используем эту процедуру в лаборатории для изучения морфологии эмбрионов после воздействия противоэпилептических препаратов.
Приступим к выполнению целого mounts иммуногистохимического анализа эмбрионов цыпленка. Сначала вскройте яйцо, аккуратно постучав по скорлупе пинцетом и удалив ее фрагменты. Удалите плотный альбумин с помощью пинцета и осторожно наклоните желточный мешок толстым пинцетом так, чтобы эмбрион был обращен вверх.
Затем с помощью тонких ножниц вырежьте квадрат желточного мешка вокруг эмбриона. Извлеките эмбрион из желтка с помощью ложечки и поместите его в чашку с PBS под диссекционным микроскопом. Осторожно удалите мембраны желтка и перенесите эмбрион в новую чашку с PBS.
После переноса эмбриона зафиксируйте его с помощью пинцета и энтомологических булавок, затем аспирируйте PBS. Замените PBS 4% PFA в PBS и оставьте эмбрион для фиксации на один час при комнатной температуре, чтобы минимизировать возможность микробного загрязнения. Используйте деионизированную H2O на всех последующих этапах после фиксации эмбриона; аспирируйте раствор фиксатора и утилизируйте его надлежащим образом как химические отходы.
Заполните чашку раствором BS. Затем, используя нож для микродиссекции, вырежьте квадрат вокруг эмбриона, чтобы удалить лишние внезародышевые оболочки. После извлечения энтомологических булавок удалите их пинцетом. С помощью пастуральной пипетки с тупым концом перенесите эмбрион в сцинтилляционную пробирку, содержащую PBT.
Трижды промойте эмбрион в PBT, выдерживая по 10 минут после каждой промывки. Удалите PBT из сцинтилляционной пробирки и замените его на PBTX, содержащий 0,3% H₂O₂, чтобы инактивировать возможную эндогенную пероксидазу. Инкубируйте в течение двух часов при комнатной температуре на шейкере.
Сначала промойте эмбрион в PBT трижды по 10 минут, затем трижды по 30 минут. Для окрашивания эмбриона антителами начните с промывания эмбриона в течение одного часа в блокирующем буфере или 1% BSA 1% NGS.
Мы используем NGS, так как вторичные антитела были получены на козах. После инкубации выдержите образец на мутаторе в течение одного часа при комнатной температуре; разведите первичные антитела один к одному в блокирующем буфере и инкубируйте эмбрион в этом растворе в течение двух дней при температуре 4 °C на мутаторе.
Коэффициент разведения первичных антител зависит от выбора конкретных антител. В данной работе мы используем антитела из банка гибридом из исследований развития DOMA, которые поставляются в виде супернатанта. Мы разводим их в соотношении один к одному в блокирующем буфере.
Затем выполните три 10-минутных промывки в PBT, после чего проведите три одночасовые промывки в PBT. После промывки разведите вторичные антитела в блокирующем буфере в пропорции 1:2 500. В данном случае используются конъюгированные с пероксидазой козьи антитела к IgG человека; инкубируйте эмбрион в этом раствое в течение ночи при температуре four degrees Celsius на ротаторе.
Выполните три промывки в PBT по 10 минут, затем три промывки в PBT по одному часу для развития цветовой реакции окрашенного эмбриона. Затем проведите две промывки по 20 минут в Трис-буфере (100 мМ Трис, HCl pH 7.4). После этого удалите из флакона с эмбрионом последнюю порцию Трис-буфера и замените ее пятью миллилитрами раствора DAB.
Выдержите в темноте в мутаторе в течение 20 минут. Утилизируйте наконечник в ведре с 10% раствором хлорного отбеливателя. Для деконтаминации DAB добавьте 16 µL.
Добавьте Stock H 2 0 2 в пробирку с эмбрионами в DAB. Храните в темноте. Через 10 минут проконтролируйте реакцию под микроскопом до полного завершения цветной реакции. Утилизируйте DAB в ведро с отбеливателем, заменив его пятью миллилитрами.
Промойте проточной водой. Затем проведите две 10-минутные промывки в PBS для подготовки к фотографированию и заливке в парафин. Дегидратируйте окрашенный эмбрион в серии растворов этанола 25%, 50%, 75% и 100% по 10 минут в каждом.
После дегидратации замените этанол на 0,5–1 мл кедрового масла. Это сделает эмбрион прозрачным, что позволит проводить фотографирование в кедровом масле. После фотографирования верните эмбрион в пробирку и замените кедровое масло на 100% этанол.
Наконец, замените этанол 5% раствором fast green FCF в 100% этаноле и инкубируйте в течение трех минут. Этот этап позволит визуализировать эмбрионы для гистологического исследования. Замените раствор fast green FCF 100% этанолом и приступайте к гистологической обработке.
На представленных изображениях показаны три примера окрашенных эмбрионов. Эти эмбрионы 11-й стадии помечены с помощью 15.3 B или без таковой. 15.3 B представляет собой антитело, специфичное к нодальному хорду, разработанное в лаборатории Джейн Дод и Тома Гессела.
После двух минут пребывания в DAB эмбрион остается прозрачным. Через 20 минут в DAB в узловом шнуре появляется слабое окрашивание. Наконец, через 40 минут окрашивание узлового шнура завершается.
В данном примере мы демонстрируем, как антитело PAC seven, разработанное в лаборатории Тома Джессела, распознает ранние стадии закрытия нервной трубки, а также клетки краниального нервного гребня, выходящие из среднего мозга. Здесь эмбрион помечен с помощью зонда Croc 20 из лаборатории Дэвида Уилкинсона, после чего было использовано одно антитело. Мы только что показали вам, как проводить иммуногистохимический анализ целых эмбрионов.
Данную процедуру также можно применять к эмбрионам, которые ранее прошли обработку для проведения гибридизации in situ в целом препарате. В этом случае после гибридизации in situ подвергните эмбрион краткой фиксации в течение одного часа, а затем приступайте к окрашиванию антителами. Вот и все.
Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном видео демонстрируется метод иммуногистохимии целого препарата, который используется для визуализации пространственных и временных паттернов экспрессии антигенов в эмбрионах цыплят на ранних стадиях развития. Метод включает в себя несколько этапов, в том числе фиксацию и инкубацию с антителами, для получения результатов окрашивания.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Биология развития
- Иммуногистохимия
Теоретическая база
- Иммуногистохимия целого препарата позволяет изучать распределение антигенов в эмбрионах.
- Этот метод был первоначально предложен Джейн Додд и Томом Джесселлом.
- Он дает представление о процессах развития и экспрессии генов.
- Вторичные антитела, конъюгированные с HRP, улучшают визуализацию антигенов.
Цель исследования
- Продемонстрировать процедуру иммуногистохимического анализа целого препарата.
- Визуализировать экспрессию антигена в эмбрионах цыплят.
- Сравнить преимущества данного метода по сравнению с методами использования флуоресцентных антител.
Используемые методы
- Фиксация эмбрионов в параформальдегиде.
- Гашение активности эндогенной пероксидазы.
- Инкубация с первичными и вторичными антителами.
- Проявление цветовой реакции с использованием субстрата DAB для визуализации.
Основные результаты
- Окрашивание антителами имеет оранжевый цвет, что указывает на успешное обнаружение антигена.
- После окрашивания эмбрионы можно подготовить к заливке в парафин и последующему срезанию.
- Данный метод позволяет проводить исследования локализации антигенов в поперечных срезах.
- Демонстрирует эффективность использования конъюгированных с HRP антител при окрашивании.
Выводы
- Иммуногистохимия целого препарата является ценным методом изучения эмбрионов цыплят.
- Она обеспечивает четкую визуализацию паттернов экспрессии антигенов.
- Данный метод имеет преимущества для последующего гистологического анализа.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Иммуногистохимия целого препарата эмбрионов цыпленка позволяет проводить пространственное картирование экспрессии антигенов, что способствует валидации мишеней в нейробиологии развития. Данный метод обеспечивает снижение механистических рисков путем установления связи между молекулярными мишенями и фенотипическими результатами в системе, релевантной для конкретного заболевания. Совместимость с серийным срезанием в парафине позволяет кросс-функциональным группам сопоставлять иммуногистохимические данные с гистологическим анализом, повышая трансляционную непрерывность при доклинической оценке мишеней.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем визуализации распределения антигенов в развивающейся нервной трубке и сомитах.
- Операционная ценность: способствует снижению биологических рисков за счет прямого наблюдения за взаимодействием с мишенью в интактных эмбрионах.
- Прогностическая ценность: повышает уверенность в выборе мишени, предоставляя данные об экспрессии с пространственным разрешением для идентификации ведущих соединений.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: обеспечивает получение стандартизированных, воспроизводимых паттернов окрашивания с использованием вторичных антител, конъюгированных с HRP, и субстрата DAB.
- Количественные данные: позволяет проводить полуколичественную оценку локализации антигенов по интенсивности окраски, что способствует оптимизации анализа.
- Повторное использование платформы: совместимость с изготовлением парафиновых срезов позволяет использовать один и тот же окрашенный образец для нескольких последующих аналитических рабочих процессов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: Применимо для изучения эмбриотоксического действия соединений, таких как противоэпилептические препараты, на модели позвоночных.
- Трансляционная преемственность: Обеспечивает связь между этапами поиска и доклиническими исследованиями за счет возможности последовательного отслеживания антигенов как в целых препаратах, так и в срезах.
- Снижение механистических рисков: Позволяет выяснить, коррелируют ли наблюдаемые фенотипы с модуляцией мишени в развивающихся тканях.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный метод вписывается в континуум от поиска до доклинических исследований, обеспечивая поддержку на ранних этапах валидации мишеней и разработки анализов перед оптимизацией соединений-лидеров.
- Биология открытий: облегчает проверку гипотез, выявляя пространственно-временную экспрессию антигенов в развивающемся мозге и нервной трубке.
- Скрининг: обеспечивает стандартизированные результаты иммуногистохимического анализа, что способствует воспроизводимой оценке соединений в эмбриональных системах.
- Аналитика: создает хромогенный сигнал, обнаруживаемый с помощью микроскопии в светлом поле, что позволяет проводить количественный анализ изображений для сравнения условий.
- Трансляционные исследования: способствуют согласованию биомаркеров, позволяя валидировать локализацию антигенов как в целых препаратах, так и в гистологических срезах.
- Корпоративное повторное использование: представляет собой многократно используемую платформу для гистологического анализа, применимую в различных проектах по изучению токсичности развития или экспрессии мишеней.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: снижает механистическую неопределенность путем установления связи между присутствием антигена и конкретными эмбриональными структурами.
- Операционная ценность: обеспечивает воспроизводимость за счет стандартизированных этапов фиксации, блокировки и инкубации с антителами.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении исследований (go/no-go) путем гистологического подтверждения модуляции мишени.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритезацию соединений с учетом рисков на основе профилей взаимодействия с мишенями в процессе развития.
Особенности реализации
- Требуется опыт в препарировании эмбрионов, иммуногистохимии и хромогенном детектировании.
- Необходим доступ к микроскопам, мутаторам и системам вентиляции для работы с DAB и H2O2.
- Требуется стандартизация протоколов разведения антител и промывки между исследовательскими группами.
- Адаптация метода для других видов может потребовать оптимизации этапов обеспечения проницаемости и блокировки.
- Практические ограничения включают длительное время инкубации и необходимость тщательной утилизации DAB для предотвращения появления артефактов.
