Техника для последовательного Коллекция спинномозговой жидкости из Cisterna Magna в мышь

Процедура начинается с анестезии мыши и подготовки операционного поля. Затем мышь помещают в прон-позицию (на живот) в стереотаксический прибор. Ниже затылочной области делают сагиттальный разрез кожи, после чего подкожную клетчатку и мышцы шеи тупым способом разделяют по срединной линии.

Затем заднюю часть тела укладывают таким образом, чтобы тело образовывало угол 135 градусов с зафиксированной головой, после чего стеклянным капилляром прокалывают твердую мозговую оболочку большого затылочного отверстия и собирают ЦСЖ. После забора ЦСЖ мышцы возвращают в исходное положение, кожу зашивают, и подкожно вводят около одного миллилитра 0,9% раствора NaCl для предотвращения обезвоживания; мышь поддерживают в тепле до полного восстановления. Здравствуйте, меня зовут Лю, я из лаборатории доктора Карен Дафф в Институте Топ Колумбийского университета.

Сегодня я покажу вам, как осуществлять забор спинномозговой жидкости из цистерны magna у мыши. С помощью этого метода мы можем собирать серийные образцы СМЖ до трех раз у одной и той же мыши с интервалом в два-три месяца. В нашей лаборатории мы используем этот метод для определения уровней амилоидной бета- или тау-белка в СМЖ в разные периоды жизни наших трансгенных моделей мышей с болезнью Альцгеймера и коррелируем эти значения с показателями головного мозга.

В итоге нас интересует потенциал уровней бета- или тау-белков в ЦСЖ как возможных биомаркеров прогрессирования заболевания, а также для проведения терапевтических исследований на мышах. Итак, приступим. Для данной процедуры необходимо изготовить капилляры с помощью микропипеточного подтягивателя.

В данной работе используются капилляры из силикатного стекла BOA B 175 10 от Sutter Instruments; вытягивание капилляров осуществлялось на микропипеточнике Sutter P 87 с индексами нагрева 300 и давления 330. Стеклянный капилляр имеет длину пять сантиметров и конический кончик. Кончик капилляра обрезают ножницами так, чтобы его внутренний диаметр составлял примерно 0.5 мм.

Хирургическая процедура начинается с анестезии мыши кетамином в дозе 100 mg/kg и ксилазином в дозе 10 mg/kg, вводимыми внутрибрюшинно; во время анестезии поддерживайте тепло мыши в инкубаторе при температуре 37 °C. После подтверждения полного наркоза путем проверки рефлекса отдергивания лапы при сжатии пальца, выполяйте пробное бритье в области шеи, затем поместите мышь на стереотаксический прибор, такой как представленный аппарат от David Kink. Для обеспечения прямого контакта с нагревательным ковриком введите ректальный температурный датчик, чтобы можно было регулировать нагрев коврика в соответствии с температурой тела мыши.

Зафиксируйте голову с помощью головных адаптеров, трижды протрите кожу шеи 10% раствором повидон-йода и 70% этанолом, затем сделайте сагиттальный разрез ниже задней части головы или затылка. Последующие этапы следует выполнять под диссекционным микроскопом, используя тупые пинцеты. Отделите подкожную клетчатку и мышцы M by ventor services и M rectus capita dorsalis major так, чтобы обнажилась твердая мозговая оболочка sternum magna. Используйте пару микроретракторов, чтобы развести мышцы в стороны.

Наконец, положите мышь так, чтобы голова была под углом 135 градусов к телу. Теперь мышь готова к сбору ЦСЖ. Данный метод сбора ЦСЖ из области большое цистерны (cisterna magna) был опубликован ранее.

Рисунок 1 A под диссекционным микроскопом. Твердая мозговая оболочка выглядит как блестящий и прозрачный перевернутый треугольник, через который видны продолговатый мозг и крупный кровеносный сосуд. Arteria dural spinella Рисунок 1 B. Видна циркуляторная пульсация продолговатого мозга и прилегающего пространства, заполненного CSF.

Промокните твердую мозговую оболочку стерильным ватным тампоном, введите капилляр в cisterna magna через твердую мозговую оболочку латеральнее arteria dorsalis spinalis. При правильном введении капилляра будет заметно изменение сопротивления, после чего спинномозговая жидкость начнет поступать в капилляр. После сбора спинномозговой жидкости осторожно извлеките капилляр и соедините его с трехмиллилитровым шприцем с помощью полиэтиленовой трубки с внутренним диаметром 1 мм.

Перенесите ЦСЖ в пробирку объемом 0,5 мл. Маркируйте пробирку и немедленно заморозьте ее на сухом льду. После замораживания переместите ЦСЖ в морозильник с температурой -80 °C.

Продемонстрированная техника отбора проб является крайне щадящей и позволяет повторно получать образцы СМЖ из одной и той же мыши с интервалом в два-три месяца. Таким образом, после забора проб мышцы и кожа в области шеи должны быть совмещены и закрыты швами. После наложения швов на разрез подкожно введите около одного миллилитра физиологического раствора 0,9% NACL для регидратации мыши.

Поддерживайте тепло мыши примерно при 37 °C до ее полного восстановления. Контролируйте вес животного на первый и седьмой день после операции. Я только что продемонстрировал вам способ сбора спинномозговой жидкости из цистерны magna мыши.

При выполнении данной процедуры необходимо помнить о трех важных моментах. Во-первых, правильно расположите голову и тело мыши в стереотаксической раме, чтобы область Cy Magna была максимально открыта. Во-вторых, при проколе дуроматерии капилляром будьте осторожны, чтобы не повредить кровеносные сосуды.

В противном случае ваш образец будет загрязнен кровью. И последнее, но не менее важное: пожалуйста, не забывайте поддерживать тепло мышей на протяжении всей процедуры, чтобы предотвратить гипотермию. Гипотермия не только вредна для животных, но и может существенно повлиять на ваши результаты, вызывая продукцию бета или соотношение tall hypo phosphorylation.

На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.