Протокол для культивирования симпатических нейронов крысы из верхних шейных ганглиев (SCG)

Данная процедура начинается с выделения верхних шейных симпатических ганглиев из новорожденных крыс в возрасте P0. В каждом мозге имеется два верхних шейных симпатических ганглия. Из одного помета крысят можно собрать примерно 24 ганглия.

Диссоциация ганглиев начинается с обработки в течение 30 минут. Дальнейшая диссоциация осуществляется путем многократного механического воздействия с помощью огнеполированной пастернаучной пипетки до получения суспензии одиночных клеток. Затем симпатические нейроны высевают в чашки, покрытые коллагеном ENC.

Здравствуйте, я Нила Зурин из лаборатории доктора Ллойда Грина с кафедры патологии и клеточной биологии Колумбийского университета в Нью-Йорке. Сегодня мы продемонстрируем, как выделять и культивировать первичные симпатические нейроны из верхних шейных ганглиев новорожденных красных щенков. В нашей лаборатории мы обычно используем эти клетки для изучения апоптоза в ответ на отмену фактора роста нервов.

Приступим к работе. Процедуру начинают с покрытия чашки для культивирования коллагеном из хвоста крысы за 24 часа до проведения диссекции. В зависимости от особенностей эксперимента используют 24- или 48-луночный планшет для культивирования.

Затем будут приготовлены среды для растворов и оборудование. Эти материалы и реагенты указаны в текстовом протоколе, который прилагается к данному видео. Важно отметить, что раствор уридина и 5-FDU следует готовить непосредственно перед использованием.

Продолжите подготовку с помощью горелки. Отполируйте стеклянные пастернауэровские пипетки для этапов титрации. Кончик стеклянной пипетки удерживают в пламени в течение нескольких секунд, вращая её для сужения и сглаживания.

Первоначальную огневую стерилизацию следует проводить в стерильном ламинарном шкафу для культуры клеток. Для начала диссекции возьмите новорожденных крысят в возрасте от P0 до P1. Чтобы снизить риск контаминации, поверхность тела новорожденного крысенка быстро протирают 70% ethanol.

После декапитации голову помещают на препаровальный коврик вентральной стороной вверх, ориентируя хвостовой конец к себе. Перерезанная трахея должна быть хорошо видна. Для фиксации отделенной головы к препаровальному коврику используют стерильные иглы шприцев следующим образом.

Проткните одну булавку через небо в подложку, а вторую — через пересеченный спинной мозг в подложку. Переместите препарировочную подложку под микроскоп и, глядя в окуляры, с помощью двух пинцетов удалите кожу и жировую ткань вокруг трахеи. Осторожно, не углубляясь слишком сильно, обнажите пару мышц, расположенных почти параллельно друг другу по обе стороны от трахеи.

В процессе диссекции потребуется промывание холодным стерильным PBS или холодным бессывороточным питательным средьем RPMI 1640 с помощью стерильной пастеровской пипетки для удаления излишков крови. Эту процедуру можно выполнить один или несколько раз, в зависимости от скорости работы. Затем с помощью пинцета сначала рассекают и удаляют мышцу с одной стороны.

После удаления мышцы станет видна сонная артерия. Эта артерия проходит вдоль трахеи и раздваивается, напоминая ленту в форме буквы Y. Эта бифуркация является важным ориентиром, и после её обнаружения будет относительно легко найти верхние шейные ганглии.

Артерию пересекают на самом дистальном конце и слегка приподнимают пинцетом. Другой конец артерии оставляют прикрепленным. После этого становится виден верхний шейный ганглий.

Необходимо убедиться, что это небольшая глянцевая масса ткани миндалевидной формы, слабо прикрепленная к артерии в точке бифуркации, имеющая нитевидные пре- и/или постганглионарные соединительные волокна. Второй парой пинцетов аккуратно отделяют верхний шейный ганглий и помещают его в маленькую культуральную чашку диаметром 35 миллиметров, содержащую холодную среду RPMI 1640 без сыворотки. Затем, следуя тому же протоколу, извлекают ганглий с другой стороны трахеи.

После того как все ганглии будут выделены, их максимально очищают от посторонних тканей. При наблюдении в микроскоп можно заметить, что к ганглиям прикреплены фрагменты жира сонной артерии или другие ткани; для удаления этих ненужных материалов используют пинцет. Также обрезают пре- и/или постганглионарные соединительные волокна.

Каждый ганглий содержит около 10 000 нейронов. После высева нейронов они восстанавливают свои отростки. Затем ганглии помещают в стерильную коническую полипропиленовую пробирку объемом 15 миллилитров, содержащую среду RPMI 1640.

Затем создают культуру симпатических нейронов. Ганглии центрифугируют при 200 G в течение двух минут, после чего супернатант удаляют. Ганглии ресуспендируют в 0,5–1 мл 0,25% раствора трипсина, а затем помещают в водяную баню или инкубатор при 37 °C на 30 минут для диссоциации клеток ганглиев.

Через 30 минут добавляют 10 миллилитров полной среды, чтобы разбавить и нейтрализовать трипсин. Затем растворы центрифугируют при 200 G в течение двух минут. Супернатант удаляют, а ганглии ресуспендируют в двух миллилитрах конечной среды.

Используя один из заранее подготовленных огнеполированных наконечников пипеток с широким отверстием, клетки подвергают дальнейшей диссоциации путем перемещения ганглиев вверх-вниз 20 раз. Затем пробирку помещают на лед на несколько минут. После этого кончик пипетки снова подвергают огнеполировке, чтобы сделать отверстие еще более узким.

После охлаждения пипетки ганглии подвергают тритурации еще 20 раз. Среда будет постепенно становиться более мутной, что указывает на диссоциацию клеток. Этот этап повторяют один или два раза в зависимости от степени диссоциации клеток.

Спустя некоторое время ганглии диссоциируют на нейроны, и в пробирке не будет видно целых ганглиев. На этом этапе может остаться часть тканевого материала, которая не подверглась диссоциации. Пробирку оставляют на льду на несколько минут, чтобы любой недиссоциированный дебрис осел на дно.

Весь супернатант, за исключением примерно 50 µL, осторожно собирают и переносят в другую пробирку. 50 µL оставляют на дне пробирки, чтобы предотвратить перенос несвязанного клеточного дебриса. В пробирку с диссоциированными клетками добавляют дополнительный объем конечной среды.

Объем добавляемой конечной среды зависит от типа культуральной пластины. Используйте ее для культивирования нейронов. Например, если используется 24-луночный планшет, поместите по одному ганглию в каждую лунку в 0,5 миллилитров конечной среды на лунку.

Типичный помет крыс состоит из 12 детенышей, что дает 24 ганглия. Этого достаточно для заселения одного 24-луночного планшета, при этом общий объем конечной среды составляет 12 миллилитров. Использование уридина 5-фтор-2'-дезоксиуридина (5-FdU) в конечной среде предотвратит пролиферацию и будет способствовать гибели небольшой популяции глии и других типов клеток.

В культуре клетки подпитывают каждые 48 часов, заменяя две трети среды на свежую среду RPMI с добавлением 1% сыворотки лошади, NGF, уридина и пяти FDU. Первоначально культура содержит симпатические нейроны округлой формы без выраженных нейритов.

Короткие нейроны становятся видимыми через 24 часа после препарирования, а со временем их плотность увеличивается, и они становятся более разветвленными. Мы только что продемонстрировали вам способ выделения и культивирования первичных симпатических нейронов из верхних шейных ганглиев новорожденных крыс. При выполнении этой процедуры важно помнить о следующем: во-первых, уделяйте достаточно времени и внимания очистке ганглиев, удаляя весь детрит, кровеносные сосуды и жировую ткань.

Этот этап важен для получения более или менее гомогенной культуры, очищенной от посторонних типов клеток. Во-вторых, на этапе диссоциации проявите терпение и уделите достаточно времени разделению нейронов, чтобы они не оставались в виде крупных кластеров. После посева на планшеты наличие крупных кластеров создаст определенные трудности.

В последующих приложениях, таких как перерезка или инфицирование нейронов, иммуноокрашивание также может быть затруднено, и любые эксперименты, требующие подсчета нейронов, будут сложно реализовать. Наконец, нет необходимости дополнять среду пенициллином-стрептомицином. Добавления пенициллина-стрептомицина при самом первом посеве клеток достаточно, и повторно добавлять его при смене среды не требуется.

Добавляйте свежий уридин пятифторурацил (FDU) в среду при каждой замене среды. В нашей лаборатории использовалась культура симпатических нейронов для изучения апоптоза в ответ на отмену фактора роста нервов. На этом всё.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.