Протокол для культивирования симпатических нейронов крысы из верхних шейных ганглиев (SCG)

Эта процедура начинается с выделения верхних шейных симпатических ганглиев от неонатальных крыс с нулевым уровнем P. Каждый мозг имеет два верхних шейных симпатических ганглия. Примерно 24 ганглия могут быть собраны из одного помета крысят.

Диссоциация ганглиев начинается с поездок и лечения в течение 30 минут. Дальнейшая диссоциация осуществляется путем многократного повторения с помощью отполированной огнем пипетки для вредителя, в результате чего получается одноклеточная суспензия. Затем симпатические нейроны наносятся на посуду, покрытую коллагеном ENC.

Здравствуйте, я Нила Зурин из лаборатории доктора Ллойда Грина на кафедре патологии и клеточной биологии Колумбийского университета. Сегодня мы покажем, как выделить и культивировать первичные симпатические нейроны из верхних шейных ганглиев новорожденных рыжих щенков. В нашей лаборатории мы обычно используем эти клетки для изучения апоптоза в ответ на отмену фактора роста нервов.

Итак, приступим. Мы начинаем процедуру с покрытия питательной чашки коллагеном из крысиного хвоста за 24 часа до проведения вскрытия. В зависимости от характера эксперимента используется культуральная тарелка на 24 лунки или на 48 лунок.

Далее будут подготовлены растворы и оборудование. С этими материалами и реактивами можно ознакомиться в текстовом протоколе, который прилагается к этому видео. Важно отметить, что раствор уридина и пяти FDU следует принимать непосредственно перед использованием.

Продолжайте приготовление у костра. Полировка стеклянных пастбищных пипеток для этапов таирования. Кончик стеклянной пипетки удерживается в пламени в течение нескольких секунд, вращаясь для сужения и сглаживания.

Первый огонь полировки следует проводить в стерильном клеточном культурном колпаке. Чтобы начать вскрытие, соберите от P ноль до P одного новорожденного крысы. Новорожденного детеныша крысы быстро протирают 70% этанолом для уменьшения загрязнения.

После обезглавливания голова помещается на подушечку для вскрытия брюшной стороной вверх, а конец початка направлен на вас. Разорванная трахея должна быть хорошо видна. Стерильные иглы шприца используются для крепления отрубленной головки к препарирующей прокладке следующим образом.

Протолкните один штифт через нёбо в подушечку, а второй — через разорванный спинной мозг в подушечку. Переместив препарирующую подушечку под эндоскоп и посмотрев в окуляры, с помощью двух пар щипцов удалите кожу и жир вокруг трахеи. Стараясь не погружаться слишком глубоко, пара мышц, идущих почти параллельно друг другу, будет обнажаться по обе стороны трахеи.

Во время вскрытия вам нужно будет провести орошение холодным стерильным PBS или средой RPMI 1640 без холодной сыворотки, поставляемой с помощью стерильной пастбищной пипетки, чтобы смыть лишнюю кровь. Это может быть сделано один или несколько раз, в зависимости от скорости работы. Затем щипцы сначала используются для разрезания и удаления мышцы с одной стороны.

Как только мышца будет удалена, сонная артерия станет видимой. Эта артерия проходит вдоль трахеи и разветвляется в нечто похожее на Y-образную ленту. Эта бифуркация является важным ориентиром, и как только она будет обнаружена, будет относительно легко найти верхние шейные ганглии.

Артерия перерезается на самом зубчатом конце и немного приподнимается с помощью щипцов. Другой конец артерии остается прикрепленным. Как только это будет сделано, верхний шейный ганглий станет видимым.

Следует видеть, что это миндалевидная, глянцевая на вид небольшая масса ткани, слабо прикрепленная к артерии в точке бифуркации, и что она имеет нити, похожие на пре- и или постганглионарные соединения. Вторая пара щипцов используется для аккуратного отделения верхнего шейного ганглия и помещения его в небольшую 35-миллиметровую чашку для культуры, содержащую среду RPMI 1640 без холодной сыворотки. Далее ганглий извлекается с другой стороны трахеи по тому же протоколу.

После того, как все ганглии будут рассечены, они освобождаются как можно больше от посторонних тканей. Глядя в эндоскоп, можно заметить, что к ганглиям прикреплены кусочки жира сонной артерии или другие тканевые щипцы, используемые для удаления этих нежелательных материалов. Пре и/или постганглионарные соединения также обрезаются.

Каждый ганглий имеет около 10 000 нейронов. Как только нейроны будут покрыты, они снова отрастут очищенными нейронами. Затем ганглии помещают в стерильную коническую полипропиленовую трубку объемом 15 миллилитров, содержащую среду RPMI 1640.

Затем устанавливается культура симпатических нейронов. Ганглии центрифугируют при 200 G в течение двух минут, а снэт выбрасывают. Ганглии ресуспендируют в 0,5-1 миллилитрах 0,25% раствора трипсина, а затем помещают на водяную баню или в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия на 30 минут, чтобы помочь диссоциировать клетки в ганглиях.

Через 30 минут добавляют 10 миллилитров готовой среды с целью разбавления и нейтрализации трипсина. Затем растворы центрифугируют при 200 G в течение двух минут. Затем суперагент отбрасывают, а ганглии ресуспендируют в двух миллилитрах конечной среды.

С помощью одного из заранее подготовленных наконечников пипетки, отполированных огнем с широким отверстием, клетки дополнительно диссоциируются тремя ганглиями вверх и вниз 20 раз. Затем трубку помещают на лед на несколько минут. Затем пипетку снова полируют огнём, чтобы сделать отверстие ещё уже.

После того как пипетка остынет, ганглии растираются еще в 20 раз. Среда будет становиться все более мутной, что указывает на то, что клетки диссоциируют. Этот шаг повторяется еще один или два раза в зависимости от того, насколько хорошо клетки диссоциируют.

Через некоторое время ганглии диссоциируют на нейроны, и в трубе не будет видно неповрежденных ганглий. Может быть какой-то тканевый материал, который не будет диссоциироваться на этом этапе. Трубку оставляют на льду на несколько минут, чтобы любой посторонний мусор мог осесть на дно.

Все, кроме примерно 50 микролитров надосадочной жидкости, тщательно собирают и помещают в другую пробирку. 50 микролитров оставляют на дне пробирки, чтобы предотвратить перенос постороннего мусора. Больше конечной среды добавляется в пробирку, содержащую диссоциированные клетки.

Объем добавляемой конечной среды зависит от типа питательной тарелки. Один из них используется для культивирования нейронов. Например, если предполагается использовать чашку на 24 лунки, то нанесите по одной ганглии на лунку в 0,5 миллилитра конечной среды на лунку.

Типичный крысиный помет состоит из 12 детенышей, что дает 24 ганглии. Этого достаточно для посева 1 24 лунки планшета, а общий объем конечной среды составляет 12 миллилитров. Использование уридина 5 FDU в конечной среде предотвратит пролиферацию и будет способствовать гибели небольшой популяции глии и других типов клеток.

Присутствующие в культуре клетки покармливают каждые 48 часов, заменяя две трети среды. Со свежим RPMI плюс 1% лошадиная сыворотка плюс NGF и уридин и пять FDU. Сначала культура содержит симпатические нейроны, которые выглядят круглыми без нейронов.

Короткие нейроны становятся заметными через 24 часа после вскрытия и со временем постепенно становятся более плотными и разветвленными. Мы только что показали вам, как изолировать и культивировать первичные симпатические нейроны из верхних шейных ганглиев новорожденных крыс. При выполнении этой процедуры важно помнить о том, чтобы уделить время и внимание очистке ганглий, удалить весь мусор, кровеносные сосуды и жир.

Этот шаг важен для обеспечения более или менее однородной культуры и отсутствия посторонних типов клеток. Во-вторых, на этапе диссоциации наберитесь терпения и найдите время, чтобы разделить нейроны так, чтобы они не оказались в больших скоплениях. Как только они сядут на тарелки, большие комки затруднят задачу.

В последующих приложениях, таких как трансекция или инфицирование нейронов, иммуноокрашивание также может быть затруднено, и любые эксперименты, требующие подсчета нейронов, также будут затруднены для проведения. Наконец, не стоит дополнять средство пенициллином стрептомицином. Каждый раз, когда культурам вводят дополнительный пенициллин стрептомицин, достаточно самого первого времени покрытия клеток.

Добавляйте свежий уридин пять FDU в среду каждый раз при замене среды. Наша лаборатория использовала культуру симпатических нейронов для изучения апоптоза в ответ на отмену фактора роста нервов. Вот и все.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.