Fundamentos de la crianza y destete

Lab Animal Research

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Overview

Fuente: Kay Stewart, RVT, RLATG, CMAR; Valerie A. Schroeder, RVT, RLATG. Universidad de Notre Dame, en

Millones de ratones y las ratas se crían para el uso en investigación biomédica cada año. En todo el mundo, hay varias instalaciones de cría comerciales grandes que ratones suministro a laboratorios de investigación, pero muchos servicios elegir también criar ratones y ratas in-House para reducir costos y aumentar las opciones de investigación. Cuando se cría en las instalaciones de animales, los investigadores son capaces de manipular la genética de los animales, los embarazos para satisfacer las necesidades de la investigación y trabajar con embriones y recién nacidos como lo requiere el tiempo.

Las ratas y ratones se pueden criar en una variedad de esquemas y métodos. Procedimientos técnicos, tales como el uso de la citología vaginal, visualización de la zona vaginal y la observación de enchufes de copulación, se han desarrollado para ayudar en la sincronización de la cría para corresponder a las necesidades de investigación. Este manuscrito es un resumen de los fundamentos básicos de cría de rata, ratón y procedimientos técnicos utilizados. Descripciones más detalladas de los esquemas de reproducción complejo y la descripción completa de los métodos de citología vaginal, están disponibles en la lista de referencias.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Fundamentos de la investigación de animales de laboratorio. Fundamentos de la crianza y destete. JoVE, Cambridge, MA, (2018).

Principles

Tipos comunes de las cepas y las poblaciones de

Ratones y las ratas se crían comúnmente como acciones exogámica, cepas endogámicas y variedades híbridas. Exogámica animales tienen características similares, pero no son idénticos genéticamente. Al azar se crían para mantener heterocigoto o varianza genética. En contraste, animales consanguíneos han sido mestizas con al menos 20 generaciones de hermano-hermana o padres descendencia de apareamiento y son genéticamente homocigóticos. Finalmente, los animales híbridos son la descendencia del apareamiento de dos cepas endogámicas.

Factores que afectan la crianza de comportamiento

Hay muchos factores que pueden influir en el rendimiento de la cría de ratones y ratas. El vigor de los criadores femenino depende en gran medida el nivel de endogamia. Animales que son marginados son mucho más resistentes y más vigoroso, así producen camadas más grandes y más fuertes. Algunas cepas utilizadas, como el ratón C57BL/6, Mostrar comportamientos agresivos que pueden interferir con la reproducción. Cuando una cepa agresiva de cría, camadas todos deben ser vigilados estrechamente. No puede usarse para la cría de animales de una camada con cachorros agresivos. Temperatura, humedad y fluctuaciones de iluminación pueden causar disminuciones en la eficiencia de la cría. Ruido y las vibraciones dentro de las salas de cría también se ha demostrado para causar efectos deletéreos. Control de estas variables dentro de las instalaciones de cría será minimizar algunos efectos. 1 animales con modificaciones genéticas tienden a ser menos resistente y fértil, y algunos de las mutaciones pueden resultar en mortalidad de los cachorros antes o poco después del nacimiento.

Esquemas de reproducción

Esquemas de reproducción son similares para las ratas y ratones. Sistemas más utilizados son monógamas de apareamiento de una hembra criada a uno hombre o polígamo de apareamiento de dos o más hembras criado a un macho. La mujer ratón y la rata son polyestrous y someterse a un estro postparto aproximadamente 20-24 h después del parto. Durante el celo después del parto, la hembra puede concebir una camada. Para las cepas de ratones o ratas que tienen una vida corta crianza debido a una mutación genética, es común dejar el macho en la jaula con la hembra para que ella puede concebir inmediatamente otra camada. Este esquema de crianza intensiva puede ser estresante para la mujer, ella es continuamente lactantes y gestantes. Un esquema de nonintensive implica la separación de la hembra una vez que está visiblemente embarazada; no es devuelto a la jaula del macho hasta que su camada ha sido destetado. Este sistema es mucho menos exigente en la hembra.

Manipulación genética con fines de reproducción

Animales modificados genéticamente (GEAs) son ambos animales knockout que tienen genes de su genoma o animales transgénicos que tienen genes de una especie diferente, agregó en su genoma. La prueba entonces se cría como una cepa consanguínea y se cría a menudo con otra prueba para crear un animal complejo, manipulados genéticamente para proyectos muy específicos de investigación. Esquemas complejos de cría se utilizan para crear tensiones con algunos genes quitados y otros agregado. Modelos animales para muchas gene-relacionado trastornos, incluyendo, pero no limitado a, la enfermedad de Alzheimer, cáncer, accidente cerebrovascular y otros trastornos de la sangre, diabetes y retina pigmentos-han desarrollado a través de ingeniería genética de animales.

Más planes de cría pueden depender de genética mendeliana para hacer predicciones en relación del genotipo. Cuando un ratón de tipo salvaje es criado con un ratón con un gen modificado (un heterocigoto), los resultados esperados serían animales de tipo salvaje de 50% y 50% heterocigotos. Un ratón de tipo salvaje cruzado con un ratón con genes modificados dos (un homozigoto) dará como resultado descendencia todos ser heterocigotos. Cuando se cruzan dos animales heterocigotos, todos tres genotipos deben estar presentes en los siguientes porcentajes: 25% homocigotos, tipo salvaje 25% y 50% heterocigotos. Es a partir de estas expectativas que se pueden detectar genes mortal embrionarios (es decir., si hay no hay descendencia homocigoto producido).

Figure 1
Figura 1. Cruzamientos posibles y los resultados basan en la genética mendeliana. Animales de tipo salvaje no son modificados genéticamente y se señalan como (+ / +). Animales heterocigotos tienen una copia de un gene modificado y se señalan como (-/ +); animales homocigotos tienen dos copias de un gen modificado y se señalan como (- / -).

Millones de ratones y las ratas se crían para el uso en investigación biomédica cada año, y muchas instituciones deciden esto en casa reducir costes y aumentar opciones de investigación. Son las ventajas de la crianza interna, 1) los investigadores son capaces de manipular la genética de los animales mediante la cría selectiva 2) que tiempo de embarazo para satisfacer las necesidades de investigación, y 3) pueden trabajar con embriones y recién nacidos según sea necesario. Sin embargo, para configurar un esquema de cría exitosa, uno debe entender el ciclo estral roedor. Además, debe tener conocimiento sobre los diferentes esquemas de apareamiento, los factores que afectan el comportamiento reproductivo del roedor y las consideraciones al destete... todo lo cual será discutido en este vídeo de presentación.

Vamos a empezar con la revisión de ciclo estral roedor. Ratas y ratones son polyestrous, decir que tienen más de un estro ciclo en un año o una temporada de cría. Cada ciclo tiene una duración de 4-5 días y se puede dividir en 4 etapas: metestro, diestro, proestro y estro. Estro es la fase ovulatoria, que significa que si la mujer está en el proestro o en la fase de estro, está listo para concebir.

Una forma para determinar la etapa del ciclo estral es por examen visual. Restringir manualmente el animal por la cola y con las patas delanteras apoyadas sobre una tapa de la jaula e inspeccione cuidadosamente el tamaño de la abertura vaginal y el tejido circundante. Durante la fase de proestro, la abertura vaginal es amplia y se caracteriza por la hinchazón de los tejidos circundantes, que es en color rosa y muy húmedo. A menudo hay arrugas o estrías a lo largo de los bordes dorsales y ventrales de la abertura. Durante el estro, la hinchazón que rodea que la abertura vaginal se reduce y los tejidos no son tan húmedos y rosados. Durante el metestro, la abertura vaginal es mínima y hay inflamación insignificante. Durante el diestro, sin inflamación de los tejidos alrededor del área vaginal y la apertura es pequeño o cerrado.

Otro enfoque más preciso para determinar la etapa del ciclo estral es la citología vaginal para que la célula las muestras se recogen mediante lavado o vajillas. Para lavado, coloque un bulbo de látex en el extremo de una punta estéril 200-microlitro y elaborar aproximadamente 100 microlitros de agua bidestilada estéril dentro de la pipeta. A continuación, levante el ratón fuera de la jaula y le coloque encima el alambre barra jaula con su cola hacia usted. Sujete la cola firmemente y elevar los cuartos traseros del ratón que sólo las patas delanteras están agarrando la tapa. Coloque el extremo de la punta de llenado en la apertura de la vagina sin penetrar en el orificio. Presione suavemente la bombilla para expulsar aproximadamente 25-50 microlitros de agua en la abertura vaginal. Espontáneamente se aspire el líquido en el canal sin la inserción de la punta. Suelte lentamente la presión ejercida sobre el bulbo y el fluido se retirará hacia la punta. Repetir 4 - 5 veces con la misma punta, bulbo y fluido para obtener un número suficiente de células en una sola muestra. Colocar el líquido en portaobjetos de vidrio y permitir el frotis a completamente seco a temperatura ambiente. Una vez seco, estos frotis estros pueden almacenarse para uso posterior o puede ser mancharon inmediatamente utilizando la tinción de Wright-Giemsa, que es una mancha de un solo paso y hace que no requiere fijación. La diapositiva se coloca en la mancha durante 45 a 60 segundos.

Por otro lado, para vajillas, moje un aplicador con punta de algodón de 2 mm con solución salina. Inserte la punta del aplicador en la vagina del ratón restringida y suavemente gire y rodar la punta contra la pared vaginal. Luego retire con cuidado la torunda y transferir las células a un portaobjetos de vidrio seca girando la torunda a través de la diapositiva. Este procedimiento se considera estresante y puede causar daños si no se realiza suavemente, con el alojamiento adecuado y con los hisopos de algodón de tamaño correcto. Como el lavado, una vez seca, la diapositiva se puede teñir con la tinción de Wright-Giemsa. Después de la coloración, las diapositivas pueden ser examinadas bajo un microscopio.

Si la hembra está en proestro, las células se consideran como racimos de redondo, bien formado, nucleated células epiteliales con un núcleo que las manchas más oscuras que el citoplasma. Si ella está en fase de estro, la mayoría de las células son las células epiteliales squamous cornified que carecen de un núcleo. Son angulares en aspecto y están en racimos densamente. Si la hembra está en metestro, las células suelen ser leucocitos, especialmente neutrófilos, con algunas células epiteliales squamous cornified presente. Durante el diestro, las células presentes son normalmente las células blancas de la sangre con la aparición de algunas células epiteliales nucleadas.

Ahora que tienes un entendimiento del ciclo estral roedor, vamos a discutir cómo configurar acoplamiento. Primer paso es la determinación del sexo, que se realiza comparando las distancias anogenitales. En las hembras, la distancia entre el ano y los genitales externos es más corta que es para los varones. Basado en las necesidades de investigación y eficiencia de cría de la cepa, el esquema de apareamiento puede ser monógamo, donde una hembra criado a un macho o polígamo--donde se crían dos o más hembras a un macho.

En términos de tiempo, dado que el ciclo estral roedor es corto-sólo 4-5 días de largo y uno puede establecer apareamiento al azar. O puede configurar "tiempo de apareamiento", que implica la introducción de hembra a la jaula del acoplamiento cuando ella está en el punto de máxima receptividad y fertilidad-que es durante el proestro o en la fase de estro. En cualquier caso, el acoplamiento debe configurarse al final del día, como roedores son nocturnos y suelen aparearse en la noche. A la mañana siguiente, la mujer se examina para enchufe copulador - una masa blanquecina consisten en flujo vaginal y semen que persiste por cópula después de 12-24 horas. Si el enchufe copula no es visualmente evidente, inserte suavemente la punta de una sonda Roma en la abertura vaginal. La presencia de un tapón de copula impedirá el avance de la sonda dentro de 0.5 cm de la abertura vaginal. En el caso de apareamiento aleatorio, enchufe copulador aspecto comúnmente tarda tres días. La presencia de un tapón confirma apareamiento no garantiza que la mujer está embarazada.

Una vez que se observa un tapón de copulación, la hembra debe ser vigilada para detectar signos de embarazo como el aumento de peso. Si la mujer tapada está embarazada, entonces el día se encontró el enchufe es embrionario día cero o E0 y al día siguiente se considera como el primer día de gestación, o E1, derecha y así sucesivamente hasta el parto-es dar a luz, que es entre los días 19 a 21. Aproximadamente 20-24 horas después del parto, ratas y ratones se someten a un estro y pueden concebir otra vez.

En un esquema de cría intensiva, que se utiliza comúnmente para los animales con una crianza corta vida debido a una mutación genética, los animales masculinos se quedan en la jaula con la hembra y los cachorros, para que la hembra puede concebir otra camada inmediatamente. Este esquema puede ser estresante para la mujer es continuamente lactantes y gestantes. Por el contrario, el esquema de crianza no intensiva, consiste en separar a la hembra una vez que está visiblemente embarazada y no le regresa a la jaula del macho hasta que su camada ha sido destetado, lo menos exigente esquema de cría.

Hay muchos factores que pueden influir en el rendimiento de la cría de ratones y ratas. Vamos a repasar algunas de ellas, que surgen con más frecuencia. El vigor de los criadores femenino depende en gran medida el nivel de endogamia. Animales que son marginados son mucho más resistentes y vigorosas, así producen camadas más grandes y más fuertes. Otro factor que puede afectar al rendimiento de la cría es el comportamiento agresivo. Algunas cepas utilizadas, tales como ratones C57BL/6, tienen una tendencia a mostrar la agresión, que puede interferir con la reproducción. Cuando una cepa agresiva de cría, camadas todos deben ser vigilados estrechamente. No puede usarse para la cría de animales de una camada con cachorros agresivos. Temperatura, humedad y fluctuaciones de iluminación pueden causar disminuciones en la eficiencia de la cría. Ruido y las vibraciones dentro de las salas de cría también se ha demostrado para causar efectos deletéreos. Animales con modificaciones genéticas tienden a ser menos resistente y fértil, y algunos de las mutaciones pueden resultar en mortalidad de los cachorros antes o poco después del nacimiento.

Ahora vamos a repasar brevemente cómo destetar crías de estos animales de laboratorio. El momento de empezar el destete se diferencia con el esquema de cría. En el caso de la cría no intensiva, los jóvenes pueden ser destetados a los 21-28 días de edad. Pero en el caso de cultivos intensivos, los cachorros de cada camada son destetados a los cachorros día 20 para evitar que el más viejo de estar presente cuando la próxima camada de nacido. Desde roedores pueden comenzar tan sólo 8 semanas de apareamiento, cachorros machos y hembras se separan al destete. Siempre que sea posible, los cachorros recién destetados deben no alojados individualmente.

Si una camada contiene sólo un cachorro de un sexo determinado, deben hacerse intentos para albergar este cachorro cachorros del mismo género de otra camada. Las opciones de vivienda posible destete los cachorros aparecen en el manuscrito más abajo. Ratas y ratones destetados se deben revisar diariamente para asegurar que están prosperando. Suministro de alimentos, una cantidad pequeña de comida, un perdigón por ratón, debe colocarse en el piso de la jaula para los primeros 7-10 días, con alimentos adicionales en la parte superior de la jaula. Esto animará a los animales a la transición a tener roedor chow como su fuente de alimento único. Abastecimiento de agua, una botella debe agregarse incluso si los animales se alojan en racks con sistema de riego automático. Esto es para evitar la deshidratación.

Por último, vamos a ver cómo los científicos están utilizando el enfoque de mejoramiento interno a su ventaja. Una de las aplicaciones más comunes de configuración de apareamiento es desarrollar ratones con genotipo alterado. Para estudiar la función del gen, los investigadores a menudo alteran su código genético. Sin embargo, estos animales como los seres humanos son diploides y por lo tanto tienen dos copias del mismo gen. Por lo tanto, para interrumpir completamente el gen, los ratones alterados necesitan ser criados para producir un animal con dos copias disfuncionales, en otras palabras un nocaut en el homocigoto. Ratones con una copia de disfuncional se llaman heterocigotos o hets.

La otra ventaja de establecer apareamiento interno está probando el efecto de la exposición prenatal a los compuestos de prueba. Por ejemplo, aquí investigadores proporcionaron a mujer embarazada una dieta líquida que contenía alcohol de E7 a E13. Luego en E13, había diseccionado a la mujer embarazada, obtuvieron cerebros fetales y cortadas en secciones delgadas. Por último, la coloración de las diapositivas reveló que la exposición prenatal del alcohol mayor muerte celular en el tejido neural.

Por último, cría interna también permite el estudio de post embarazo trastornos como la depresión postparto. En este estudio, los científicos primero movido a la camada de la presa durante el período de lactancia. Luego, 60 minutos más tarde, volvió a los cachorros a la presa. Y para inducir estrés en la mujer, ha añadido un nuevo intruso masculino a la jaula. Entonces, los investigadores observaron la presa por agresión materna, que incluye a atacar y morder del macho intruso así como por comportamientos diferentes cuidados maternos como pup de la preparación y enfermería. Los datos obtenidos revelaron que el estrés tiene un efecto significativo sobre la agresión materna posparto y cuidado.

Sólo has visto video de Zeus sobre fundamentos de la cría y destete de ratones y ratas en el laboratorio. Ahora debería tener una mejor comprensión del ciclo estral roedores y también sabe cómo determinar la fase del ciclo y cómo utilizarlo para esquemas de apareamiento exitoso montaje. También se revisaron los factores que pueden afectar el comportamiento reproductivo, y explica cómo y cuándo destetar a ratones y ratas cachorros. ¡Como siempre, gracias por ver!

Procedure

1. información necesaria cuando se están emparejando animales incluye cepa/stock del animal utilizando la nomenclatura adecuada, las fechas de nacimiento para el criador masculino y femenino y la fecha de instalación. Mantenimiento de registros precisos es imprescindible con colonias de cría.

2. sexo determinación de ratones y ratas se realiza comparando las distancias anogenitales. En las hembras, la distancia entre el ano y los genitales externos es más corta que es para los hombres. La presencia de un saco escrotal en machos es otro indicador de sexo.

3. seleccionar y establecer el esquema de apareamiento

Nota: Hay dos esquemas de apareamiento que se pueden utilizar.

  1. Proestro/estro tiempo acoplamiento: este método se basa en pelado las hembras con los machos en el momento de máxima receptividad y fertilidad.
    1. Debe controlarse el ciclo estral en las hembras por la examinación visual de los genitales externos para los cambios que son indicativos de proestro y estro, o citología de las secreciones vaginales (véase abajo).
    2. Cuando una mujer está decidida a estar en proestro o estro, ella está emparejada con un hombre al final del día, como los animales se aparean generalmente en la noche.
    3. A la mañana siguiente, la mujer se examina un enchufe copulatoria (véase abajo). Si no hay enchufe está presente, la mujer puede permanecer con el macho durante el día y comprobada para un enchufe copula al final del día. Por otra parte, si se determina que ya no está en proestro o estro, ella se retira de la jaula de cría.
  2. Al azar tiempo acoplamiento: este método se basa en el hecho el ciclo estral de roedores es muy corto, 4-5 días.
    1. Para este método, apareamientos se pueden configurar en cualquier momento, y las hembras entonces se comprueban copula enchufes cada mañana y tarde hasta que se observe un enchufe.
    2. Una hembra se empareja con un hombre en la noche.
    3. Ella está marcada por un enchufe consistieron al principio y al final de cada día hasta que se observe un enchufe. Comúnmente se toma 3 o más días de un enchufe ser visto cuando se utiliza este método.

4. predecir embarazo

Puesto que la palpación de los cachorros es difícil hasta más tarde durante el embarazo, alrededor de 10 a 12 del día, se han desarrollado sistemas de ultrasonido comercial para roedores; sin embargo, algunos centros de investigación animal con esta tecnología. Por lo tanto, visualización de tapones copulador, observación de cambios vaginales o citología vaginal se utilizan para ayudar en la predicción de cuándo una mujer ha concebido una camada (véase abajo). Sin embargo, ninguno de estos métodos son capaces de confirmar el embarazo. Una vez que se observa un tapón de copulación, la hembra debe ser vigilada para detectar signos de embarazo, como aumento de peso.

5. determinar la fase del ciclo estral

  1. Inspección visual
    Nota: Para el tiempo de apareamiento de ratones y ratas, observación visual de la vagina para los cambios que son indicativos de proestro y estro es el método más rápido para determinar la etapa del ciclo estral, y no requiere ningún equipo especial.
    1. Al evaluar el ciclo estral mediante el método visual, es importante realizar la inspección visual en la misma zona con respecto a la iluminación de la sala, como la fuente de luz puede cambiar el color percibido de los tejidos vaginales y hacer difícil la evaluación. Por ejemplo, la tonalidad púrpura por luces dificulta la detección visual.
    2. Para evaluar la etapa del ciclo estral por observación visual, cada ratón debe manualmente restringida por la cola, con las patas delanteras apoyadas sobre una tapa de la jaula.
    3. La abertura vaginal de cada mujer se evalúa basado en la condición del tejido que rodea el área vaginal y el tamaño de la abertura vaginal. 2
      1. Durante el proestro, la abertura vaginal es amplia y se caracteriza por la hinchazón de los tejidos circundantes. El tejido es en color rosa y muy húmedo. A menudo hay arrugas o estrías a lo largo de los bordes dorsales y ventrales de la abertura.
      2. Durante el celo, la hinchazón de los tejidos que rodean la abertura vaginal se reduce y los tejidos no son tan húmedos y rosados.
      3. Durante el metestro la abertura vaginal es mínima y hay inflamación insignificante.
      4. Durante el diestro, no hay ninguna hinchazón de los tejidos alrededor del área vaginal, y la abertura vaginal es pequeña y cerrada.
  2. Citología vaginal
    Como ratones y ratas son polyestrous, la duración del ciclo estral es muy corta, que van desde 4-5 días. A veces es necesario identificar todas las cuatro etapas del estro: proestro, estro, metestro y el diestro. La citología vaginal es un método muy preciso para determinar estas etapas. También existen dos métodos de recolección de muestras: el método no invasivo de lavado vaginal y el método de hisopado de vagina.
    1. Lavado vaginal
      1. Los materiales necesarios son puntas de pipetas μl 200 estériles, bulbos de látex, estéril doble (ddH20) de agua destilación y limpiar portaobjetos de vidrio.
      2. Coloque un bulbo de látex en el extremo de una punta de 200 μL estériles. Elaborar aproximadamente 100 μl de ddH estéril2O con la pipeta.
      3. Levante el ratón fuera de la jaula y le coloque encima el alambre barra jaula con su cola hacia usted.
      4. Sujete la cola firmemente y elevar los cuartos traseros del ratón. El ratón tendrá ahora sólo las patas delanteras sujetando la tapa.
      5. Si orina de ratón, espere hasta que deje de orinar. Debe haber orina a la izquierda en la entrada a la vagina, la abertura puede ser aclarada con una pequeña cantidad de ddH2O. cambio la punta que se utilizó para el enjuague.
      6. Coloque el extremo de la punta de llenado O ddH2en la apertura de la vagina sin penetrar en el orificio.
      7. Presione suavemente la bombilla para expulsar a un cuarto a la mitad del volumen de agua (~ 25-50 μL) en la apertura del canal vaginal. Espontáneamente se aspire el líquido en el canal sin la inserción de la punta. Suelte lentamente la presión ejercida sobre el foco. El líquido se retirará hacia la punta.
      8. Evitar la liberación de presión demasiado rápido para evitar la aspiración del líquido en el bulbo. Una punta de filtrado puede ser útil para este propósito.
      9. Repita el paso anterior 4 - 5 veces con la misma punta, bulbo y fluido para obtener un número suficiente de células en una sola muestra.
      10. Colocar el líquido en portaobjetos de vidrio y permitir el frotis a completamente seco a temperatura ambiente.
      11. Utilice una nueva pipeta para cada ratón.
      12. Una vez seco, estos frotis estros pueden manchadas inmediatamente o almacenados y manchados en una fecha posterior. Tinción de Wright-Giemsa es más comúnmente utilizado para las diapositivas de la mancha. Esta mancha está disponible comercialmente como una mancha de un solo paso que no requiere la fijación de la corredera para evitar que las células del lavado durante el proceso de tinción. La diapositiva se coloca en la mancha durante 45-60 segundos, según las instrucciones del fabricante.
      13. Las diapositivas son luego examinados bajo el microscopio y las células vistas corresponden a la etapa del ciclo: 1) si la mujer está en proestro, las células se ven como racimos de redondo, bien formado nucleated células epiteliales con un núcleo que las manchas más oscuras que la citoplasma; 2) si la hembra está en celo, la mayoría de las células son las células epiteliales squamous cornified que carecen de un núcleo, son angulares en apariencia y ocurren en racimos densamente; 3) si la mujer está en metestro, las células son glóbulos blancos (especialmente neutrófilos con algunas células epiteliales squamous cornified presente) con núcleos teñidos de oscuro que se forman de dos salchichas Unidas entre sí; 4) durante el diestro, las células presentes son normalmente las células blancas de la sangre con la aparición de algunas células epiteliales nucleadas...
    2. Hisopado vaginal
      1. Los materiales necesarios son aplicadores con punta de algodón estériles con una punta de 2 mm de diámetro, portaobjetos de vidrio limpio y solución salina fisiológica estéril.
      2. Moje un aplicador con punta de algodón con solución salina.
      3. Introduzca la punta del aplicador en la vagina del ratón restringida.
      4. Suavemente gire y ruede la punta contra la pared vaginal. Retire con cuidado la torunda.
      5. Las células se transfieren a un portaobjetos de vidrio seca girando la torunda a través de la diapositiva.
      6. Una vez seca la diapositiva, puede ser teñido con tinción de Wright-Giemsa.
        Aplicador se considera un procedimiento estresante, y -cuando ratones subrayó pueden haber interrumpido ciclos estruales. Estimulación vaginal y del cuello uterino causada por hisopado puede inducir seudoembarazo. Repetidos frotis de la mucosa vaginal pueden causar daño si no es realizaron, con el alojamiento adecuado y con los hisopos de algodón de tamaño correcto. 3, 4

Figure 2
Figura 2. Citología vaginal--diferentes fases del estro roedor ciclo

6. visualizar un enchufe copulatoria

Este enchufe consta de semen y fluido vaginal y persiste en la vagina para postcopulation de 12-24 h. La presencia del tapón confirma el apareamiento, pero no garantiza que la mujer está embarazada. Si la mujer tapada está embarazada, el primer día de gestación se considera el día después de que el enchufe se encuentra.

  1. Levante el ratón fuera de la jaula y le coloque encima el alambre barra jaula con su cola hacia usted.
  2. Posición del ratón mediante la aplicación de presión justo por encima de la cola a arquear la espalda para permitir la mejor presentación de la abertura vaginal.
  3. Observar su abertura vaginal de una masa blanquecina. El enchufe copula no puede ser visualmente evidente pero puede confirmarse con el uso de una sonda Roma.
  4. Suavemente con la punta de la sonda, introduzca en la abertura vaginal. La presencia de un tapón de copula impedirá el avance de la sonda dentro de 0.5 cm de la abertura vaginal.
  5. La sonda debe desinfectarse con alcohol y secar completamente antes de cada uso.

Como la hembra tiene camadas, la fecha de nacimiento, el tamaño de camada, el número de nacidos, el número de destetados, la proporción de hombres y mujeres cachorros y la proporción de los genotipos debe ser registrada. Si los genotipos dentro de una camada no corresponden a los genotipos de los padres, repetir el análisis debe hacerse para verificar el verdadero genotipo.

7. el destete

La gestación de ratones y ratas es de aproximadamente 21 días. Los jóvenes son destetados a los 21-28 días de edad. Ambos ratones y ratas pueden reproducirse tan pronto como 8 semanas de edad, por lo tanto es imperativo que las crías están separadas por sexo a una edad temprana. Cría intensiva requiere que los cachorros de cada camada se destetan a día 20 para evitar que los cachorros mayores de estar presente cuando nace la siguiente camada. Para la cría de nonintensive, los cachorros pueden dejarse con la madre pasados 20 días de edad, a menudo hasta 28 días de edad. Esto puede ser muy beneficioso para muchas variedades genéticamente modificadas, pues los cachorros pueden no ser tan vigorosos como nonengineered o animales de tipo salvaje.

Cachorros machos y hembras se separan al destete. Siempre que sea posible, los cachorros recién destetados deben no alojados individualmente. Si una camada contiene sólo un cachorro de un sexo determinado, deben hacerse intentos para albergar este cachorro con otros del mismo género. Opciones de alojamiento posibles son: 1) una sola cría hembra puede permanecer con la madre, si no en una jaula de cría intensiva; 2) una sola cría hombre o mujer puede colocarse con otros cachorros del mismo género de una camada diferente de la misma edad; 3) si los padres son una pareja monógama, se puede quitar la hembra de la jaula para permitir que una sola cría macho que se encuentra con el padre; y 4) una sola cría macho puede ubicada con hermanos femeninos hasta 5 semanas de edad. El sexo de los cachorros debe ser verificado una semana posdestete para evitar camadas no deseadas de crías mal segregados.

Ratas y ratones destetados se deben revisar diariamente para asegurar que están prosperando. Aunque la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio5 indica que alimentos deben presentarse a los animales de tal manera para evitar ser manchado por las heces y la orina, se deberá una cantidad pequeña de comida (un perdigón por a ratones recién destetados ratón) se coloca en un plato de vidrio (placa Petri) en el piso de la jaula. Esto animará a los animales a la transición a tener roedor chow como su fuente de alimento único. Incluso para los animales que se encuentran en los estantes que proporcionan agua a las jaulas a través de un sistema de riego automático, una botella de agua puede añadirse a la jaula si los ratones parecen estar deshidratado.

Nombre Tipo de Colonia Descripción
ICR Marginado Albino
Swiss-Webster Marginado Albino
BALB/c Endogámicas Albino
FVB Endogámicas Albino
C57BL/6 Endogámicas Color de capa negro
C3H Endogámicas Color de capa marrón
DBA/2 Endogámicas Color de la capa marrón/gris
Desnudos atímicos (nu/nu) Endogámicas Sin pelo
SCID Endogámicas Grave combinado colores de capa varios ratones inmune deficiente

Tabla 1. Usan con manchas de ratón y las acciones.

Nombre Tipo de Colonia Descripción
Sprague-Dawley Marginado Albino
Wistar Marginado Albino
Fisher 344 Endogámicas Albino
Lewis Endogámicas Albino
Largo Evans Endogámicas Con capucha, negro y blanco

Tabla 2. Las acciones y las tensiones de la rata utilizado

Summary

Colonias de cría internos ofrecen flexibilidad a la investigación, sobre todo con proyectos que utilizan embriones o recién nacidos. Usando técnicas tales como tiempo de apareamiento con enchufes copulatoria y citología vaginal, la fecha de concepción y gestación puede más exactamente predecir. Esto permite a los investigadores planificar más cuidadosamente sus experimentos. Controlar factores ambientales como los ciclos de luz, temperatura, humedad y vibraciones optimizará los resultados de cría.

References

  1. Breeding Strategies for Maintaining Colonies of Laboratory Mice. A Jackson Laboratory Resource Manual. http://ko.cwru.edu/info/breeding_strategies_manual.pdf.
  2. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., and Taft, R. A. 2012. Mouse estrous cycle identification tool and images. PloS One. 7, 1-5.
  3. McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. 2012. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J. Vis. Exp. 67, e4389. doi:10.3791/4389.
  4. Mamrot, J., Pangestu, M., Walker, D., Gardner, D. K., and Dickerson, H. 2015. Confirmed dioestrus in pseudopregnant mice using vaginal exfoliative cytology improves embryo transfer implantation rate. Reproductive BioMedicine Online. 31. 538-543.
  5. Institute for the Laboratory Animal Research. 2011. Guide for the care and use of laboratory animals, 8th ed. Washington (DC): National Academies Press.

1. información necesaria cuando se están emparejando animales incluye cepa/stock del animal utilizando la nomenclatura adecuada, las fechas de nacimiento para el criador masculino y femenino y la fecha de instalación. Mantenimiento de registros precisos es imprescindible con colonias de cría.

2. sexo determinación de ratones y ratas se realiza comparando las distancias anogenitales. En las hembras, la distancia entre el ano y los genitales externos es más corta que es para los hombres. La presencia de un saco escrotal en machos es otro indicador de sexo.

3. seleccionar y establecer el esquema de apareamiento

Nota: Hay dos esquemas de apareamiento que se pueden utilizar.

  1. Proestro/estro tiempo acoplamiento: este método se basa en pelado las hembras con los machos en el momento de máxima receptividad y fertilidad.
    1. Debe controlarse el ciclo estral en las hembras por la examinación visual de los genitales externos para los cambios que son indicativos de proestro y estro, o citología de las secreciones vaginales (véase abajo).
    2. Cuando una mujer está decidida a estar en proestro o estro, ella está emparejada con un hombre al final del día, como los animales se aparean generalmente en la noche.
    3. A la mañana siguiente, la mujer se examina un enchufe copulatoria (véase abajo). Si no hay enchufe está presente, la mujer puede permanecer con el macho durante el día y comprobada para un enchufe copula al final del día. Por otra parte, si se determina que ya no está en proestro o estro, ella se retira de la jaula de cría.
  2. Al azar tiempo acoplamiento: este método se basa en el hecho el ciclo estral de roedores es muy corto, 4-5 días.
    1. Para este método, apareamientos se pueden configurar en cualquier momento, y las hembras entonces se comprueban copula enchufes cada mañana y tarde hasta que se observe un enchufe.
    2. Una hembra se empareja con un hombre en la noche.
    3. Ella está marcada por un enchufe consistieron al principio y al final de cada día hasta que se observe un enchufe. Comúnmente se toma 3 o más días de un enchufe ser visto cuando se utiliza este método.

4. predecir embarazo

Puesto que la palpación de los cachorros es difícil hasta más tarde durante el embarazo, alrededor de 10 a 12 del día, se han desarrollado sistemas de ultrasonido comercial para roedores; sin embargo, algunos centros de investigación animal con esta tecnología. Por lo tanto, visualización de tapones copulador, observación de cambios vaginales o citología vaginal se utilizan para ayudar en la predicción de cuándo una mujer ha concebido una camada (véase abajo). Sin embargo, ninguno de estos métodos son capaces de confirmar el embarazo. Una vez que se observa un tapón de copulación, la hembra debe ser vigilada para detectar signos de embarazo, como aumento de peso.

5. determinar la fase del ciclo estral

  1. Inspección visual
    Nota: Para el tiempo de apareamiento de ratones y ratas, observación visual de la vagina para los cambios que son indicativos de proestro y estro es el método más rápido para determinar la etapa del ciclo estral, y no requiere ningún equipo especial.
    1. Al evaluar el ciclo estral mediante el método visual, es importante realizar la inspección visual en la misma zona con respecto a la iluminación de la sala, como la fuente de luz puede cambiar el color percibido de los tejidos vaginales y hacer difícil la evaluación. Por ejemplo, la tonalidad púrpura por luces dificulta la detección visual.
    2. Para evaluar la etapa del ciclo estral por observación visual, cada ratón debe manualmente restringida por la cola, con las patas delanteras apoyadas sobre una tapa de la jaula.
    3. La abertura vaginal de cada mujer se evalúa basado en la condición del tejido que rodea el área vaginal y el tamaño de la abertura vaginal. 2
      1. Durante el proestro, la abertura vaginal es amplia y se caracteriza por la hinchazón de los tejidos circundantes. El tejido es en color rosa y muy húmedo. A menudo hay arrugas o estrías a lo largo de los bordes dorsales y ventrales de la abertura.
      2. Durante el celo, la hinchazón de los tejidos que rodean la abertura vaginal se reduce y los tejidos no son tan húmedos y rosados.
      3. Durante el metestro la abertura vaginal es mínima y hay inflamación insignificante.
      4. Durante el diestro, no hay ninguna hinchazón de los tejidos alrededor del área vaginal, y la abertura vaginal es pequeña y cerrada.
  2. Citología vaginal
    Como ratones y ratas son polyestrous, la duración del ciclo estral es muy corta, que van desde 4-5 días. A veces es necesario identificar todas las cuatro etapas del estro: proestro, estro, metestro y el diestro. La citología vaginal es un método muy preciso para determinar estas etapas. También existen dos métodos de recolección de muestras: el método no invasivo de lavado vaginal y el método de hisopado de vagina.
    1. Lavado vaginal
      1. Los materiales necesarios son puntas de pipetas μl 200 estériles, bulbos de látex, estéril doble (ddH20) de agua destilación y limpiar portaobjetos de vidrio.
      2. Coloque un bulbo de látex en el extremo de una punta de 200 μL estériles. Elaborar aproximadamente 100 μl de ddH estéril2O con la pipeta.
      3. Levante el ratón fuera de la jaula y le coloque encima el alambre barra jaula con su cola hacia usted.
      4. Sujete la cola firmemente y elevar los cuartos traseros del ratón. El ratón tendrá ahora sólo las patas delanteras sujetando la tapa.
      5. Si orina de ratón, espere hasta que deje de orinar. Debe haber orina a la izquierda en la entrada a la vagina, la abertura puede ser aclarada con una pequeña cantidad de ddH2O. cambio la punta que se utilizó para el enjuague.
      6. Coloque el extremo de la punta de llenado O ddH2en la apertura de la vagina sin penetrar en el orificio.
      7. Presione suavemente la bombilla para expulsar a un cuarto a la mitad del volumen de agua (~ 25-50 μL) en la apertura del canal vaginal. Espontáneamente se aspire el líquido en el canal sin la inserción de la punta. Suelte lentamente la presión ejercida sobre el foco. El líquido se retirará hacia la punta.
      8. Evitar la liberación de presión demasiado rápido para evitar la aspiración del líquido en el bulbo. Una punta de filtrado puede ser útil para este propósito.
      9. Repita el paso anterior 4 - 5 veces con la misma punta, bulbo y fluido para obtener un número suficiente de células en una sola muestra.
      10. Colocar el líquido en portaobjetos de vidrio y permitir el frotis a completamente seco a temperatura ambiente.
      11. Utilice una nueva pipeta para cada ratón.
      12. Una vez seco, estos frotis estros pueden manchadas inmediatamente o almacenados y manchados en una fecha posterior. Tinción de Wright-Giemsa es más comúnmente utilizado para las diapositivas de la mancha. Esta mancha está disponible comercialmente como una mancha de un solo paso que no requiere la fijación de la corredera para evitar que las células del lavado durante el proceso de tinción. La diapositiva se coloca en la mancha durante 45-60 segundos, según las instrucciones del fabricante.
      13. Las diapositivas son luego examinados bajo el microscopio y las células vistas corresponden a la etapa del ciclo: 1) si la mujer está en proestro, las células se ven como racimos de redondo, bien formado nucleated células epiteliales con un núcleo que las manchas más oscuras que la citoplasma; 2) si la hembra está en celo, la mayoría de las células son las células epiteliales squamous cornified que carecen de un núcleo, son angulares en apariencia y ocurren en racimos densamente; 3) si la mujer está en metestro, las células son glóbulos blancos (especialmente neutrófilos con algunas células epiteliales squamous cornified presente) con núcleos teñidos de oscuro que se forman de dos salchichas Unidas entre sí; 4) durante el diestro, las células presentes son normalmente las células blancas de la sangre con la aparición de algunas células epiteliales nucleadas...
    2. Hisopado vaginal
      1. Los materiales necesarios son aplicadores con punta de algodón estériles con una punta de 2 mm de diámetro, portaobjetos de vidrio limpio y solución salina fisiológica estéril.
      2. Moje un aplicador con punta de algodón con solución salina.
      3. Introduzca la punta del aplicador en la vagina del ratón restringida.
      4. Suavemente gire y ruede la punta contra la pared vaginal. Retire con cuidado la torunda.
      5. Las células se transfieren a un portaobjetos de vidrio seca girando la torunda a través de la diapositiva.
      6. Una vez seca la diapositiva, puede ser teñido con tinción de Wright-Giemsa.
        Aplicador se considera un procedimiento estresante, y -cuando ratones subrayó pueden haber interrumpido ciclos estruales. Estimulación vaginal y del cuello uterino causada por hisopado puede inducir seudoembarazo. Repetidos frotis de la mucosa vaginal pueden causar daño si no es realizaron, con el alojamiento adecuado y con los hisopos de algodón de tamaño correcto. 3, 4

Figure 2
Figura 2. Citología vaginal--diferentes fases del estro roedor ciclo

6. visualizar un enchufe copulatoria

Este enchufe consta de semen y fluido vaginal y persiste en la vagina para postcopulation de 12-24 h. La presencia del tapón confirma el apareamiento, pero no garantiza que la mujer está embarazada. Si la mujer tapada está embarazada, el primer día de gestación se considera el día después de que el enchufe se encuentra.

  1. Levante el ratón fuera de la jaula y le coloque encima el alambre barra jaula con su cola hacia usted.
  2. Posición del ratón mediante la aplicación de presión justo por encima de la cola a arquear la espalda para permitir la mejor presentación de la abertura vaginal.
  3. Observar su abertura vaginal de una masa blanquecina. El enchufe copula no puede ser visualmente evidente pero puede confirmarse con el uso de una sonda Roma.
  4. Suavemente con la punta de la sonda, introduzca en la abertura vaginal. La presencia de un tapón de copula impedirá el avance de la sonda dentro de 0.5 cm de la abertura vaginal.
  5. La sonda debe desinfectarse con alcohol y secar completamente antes de cada uso.

Como la hembra tiene camadas, la fecha de nacimiento, el tamaño de camada, el número de nacidos, el número de destetados, la proporción de hombres y mujeres cachorros y la proporción de los genotipos debe ser registrada. Si los genotipos dentro de una camada no corresponden a los genotipos de los padres, repetir el análisis debe hacerse para verificar el verdadero genotipo.

7. el destete

La gestación de ratones y ratas es de aproximadamente 21 días. Los jóvenes son destetados a los 21-28 días de edad. Ambos ratones y ratas pueden reproducirse tan pronto como 8 semanas de edad, por lo tanto es imperativo que las crías están separadas por sexo a una edad temprana. Cría intensiva requiere que los cachorros de cada camada se destetan a día 20 para evitar que los cachorros mayores de estar presente cuando nace la siguiente camada. Para la cría de nonintensive, los cachorros pueden dejarse con la madre pasados 20 días de edad, a menudo hasta 28 días de edad. Esto puede ser muy beneficioso para muchas variedades genéticamente modificadas, pues los cachorros pueden no ser tan vigorosos como nonengineered o animales de tipo salvaje.

Cachorros machos y hembras se separan al destete. Siempre que sea posible, los cachorros recién destetados deben no alojados individualmente. Si una camada contiene sólo un cachorro de un sexo determinado, deben hacerse intentos para albergar este cachorro con otros del mismo género. Opciones de alojamiento posibles son: 1) una sola cría hembra puede permanecer con la madre, si no en una jaula de cría intensiva; 2) una sola cría hombre o mujer puede colocarse con otros cachorros del mismo género de una camada diferente de la misma edad; 3) si los padres son una pareja monógama, se puede quitar la hembra de la jaula para permitir que una sola cría macho que se encuentra con el padre; y 4) una sola cría macho puede ubicada con hermanos femeninos hasta 5 semanas de edad. El sexo de los cachorros debe ser verificado una semana posdestete para evitar camadas no deseadas de crías mal segregados.

Ratas y ratones destetados se deben revisar diariamente para asegurar que están prosperando. Aunque la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio5 indica que alimentos deben presentarse a los animales de tal manera para evitar ser manchado por las heces y la orina, se deberá una cantidad pequeña de comida (un perdigón por a ratones recién destetados ratón) se coloca en un plato de vidrio (placa Petri) en el piso de la jaula. Esto animará a los animales a la transición a tener roedor chow como su fuente de alimento único. Incluso para los animales que se encuentran en los estantes que proporcionan agua a las jaulas a través de un sistema de riego automático, una botella de agua puede añadirse a la jaula si los ratones parecen estar deshidratado.

Nombre Tipo de Colonia Descripción
ICR Marginado Albino
Swiss-Webster Marginado Albino
BALB/c Endogámicas Albino
FVB Endogámicas Albino
C57BL/6 Endogámicas Color de capa negro
C3H Endogámicas Color de capa marrón
DBA/2 Endogámicas Color de la capa marrón/gris
Desnudos atímicos (nu/nu) Endogámicas Sin pelo
SCID Endogámicas Grave combinado colores de capa varios ratones inmune deficiente

Tabla 1. Usan con manchas de ratón y las acciones.

Nombre Tipo de Colonia Descripción
Sprague-Dawley Marginado Albino
Wistar Marginado Albino
Fisher 344 Endogámicas Albino
Lewis Endogámicas Albino
Largo Evans Endogámicas Con capucha, negro y blanco

Tabla 2. Las acciones y las tensiones de la rata utilizado

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