Eine Einführung in das Zentrifugieren

General Laboratory Techniques
 

Summary

Die Zentrifuge ist en Instrument, das in fast jedem Forschungslabor weltweit Verwendung findet. Das Zentrifugieren ist ein Prozess bei dem durch Verwendung einer Zentrifuge Stoffgemische in ihre verschiedenen Bestandteile getrennt werden können. Durch schnelle kreisförmige Drehbewegungen werden die einzelnen Bestandteile eines Stoffgemisches der Zentrifugalkraft ausgesetzt, was dazu führt dass Partikel mit höherer Dichte weg von der Zentrifugationsachse migrieren, wohingegen Partikel mit niedrigerer Dichte näher an der Zentrifugationsachse bleiben. Diese Partikel setzen sich am Unterboden des Zentrifugierröhrchens in einem sogenannten Pellet ab. Das Pellet oder die übrig gebliebene Lösung, auch Überstand genannt, können dann weiter verarbeitet oder analysiert werden.

Dieses Video ist dazu da um Studenten in die einfachen Grundlagen der Zentrifugierung und die Bedienung einer Zentrifuge einzuführen. Zum Beispiel wird der Unterschied zwischen Umdrehungen pro Minute (RPM) und relativer Zentrifugalkraft (RCF) als Messeinheit der Zentrifugierung erläutert, und dargestellt das RCF unabhängig von der Größe des Rotors ist. Zusätzlich zu einfachen Konzepten und Anwendungen werden Sicherheits und Vorsichtsmaßnahmen erklärt, und erläutert welche verschiedenen Zentrifugen und Rotoren es gibt.

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JoVE Science Education Database. Generelle Laborverfahren. Eine Einführung in das Zentrifugieren. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Eine Zentrifuge ist ein Instrument das in fast allen Labors weltweit genutzt wird.

Das Zentrifugieren ist ein wichtiges Laborverfahren um mit Hilfe einer Zentrifuge Stoffgemische in ihre einzelenen Bestandteile zu trennen.

Durch die gleichförmige Kreisbewegung bei hoher Geschwindigkeit werden die Bestandteile des zu zentrifugierenden Stoffgemisches der Zentrifugalkraft ausgesetzt. Dadurch migrieren Stoffe mit höherer Dichte weg von der Rotationsachse, wohingegen Stoffe mit niedrigerer Dichte näher an der Rotationsachse bleiben.

Diese Stoffe sammeln sich an der Unterseite des Zentrifugenröhrchens an, was auch als Pellet bezeichnet wird. Die übriggebliebene Lösung, auch Überstand genannt, oder das Pellet können dann weiter verarbeitet oder analysiert werden.

Der wichtigste Bestandteil einer Zentrifuge ist der Rotor, der sich kreisförmig mit hoher Geschwindigkeit bewegt. Der Rotor kann entweder fest auf der Antriebswelle montiert sein, oder mehrere Rotoren können an einer sogenannten Spindel befestigt werden. Normalerweise hat der Rotor einen Deckel, der fest angeschraubt ist, um zu vermeiden das Proben rausfliegen.

Viele Zentrifugen haben eine Kühlung eingebaut, damit die Temperatur während der Zentrifugierung kontrolliert werden kann.

Außerdem haben Zentrifugen Knöpfe und Tasten, womit man die Zentriefugierparameter eingeben kann.

zum Beispiel: die Dauer der Zentrifugierung, die Temperatur, Geschwindigkeit oder relative Zentrifugierkraft.

Die Zentrifugiergeschwindigkeit wird in RPM (auch Umdrehungen pro minute) angegeben. Bei der Einheit RPM ist zu beachten, dass nicht die Geschwindigkeit das Stoffgemisch trennt, sondern die Kraft, die auf die einzelnen Bestandteile einwirkt.

Die Kraft, die auf die zu zentrifugierenden Bestandteile einwirkt, ist abhängig vom Radius des Rotors. Verschiedene Zentrifugen haben verschieden große Rotoren, was bedeutet das die gleiche Zentrifugiergeschwindigkeit in eine andere Kraft resultiert.

Die Stärke der Zentrifugierung kann auch als relative Zentrifugalkraft, auch RCF genannt, gemessen werden. RCF wird normalerweise als Vielfaches der Erdbeschleunigung angegeben.

RCF wird berechnet durch das Produkt des Radius des Rotors und dem Quadrat der Winkelgeschwindigkeit, geteilt durch die Erdbeschleunigung.

RCF kann durch die folgende Gleichung in RPM umgerechnet werden. R ist der Radius der Zentrifuge gemessen in cm.

Das Benutzen dieser Gleichung kann den Unterschied zwischen einem erfolgreichen und einem misslungenen Experiment bedeuten. Man muss die Gleichung jedoch nicht jedes Mal von Neuem benutzen. Zentrifugen haben oft Nomogramme, mit denen man einfach RCF in RPM umrechnen kann. Hierfür benutzt man ein Lineal und verbindet den Radius der Zentrifuge mit dem RPM Wert, um dann einen RCF Wert abzulesen.

Vor Beginn des Zentrifugierens ist als erstes an die Temperatur zu denken. Wenn eine gekühlte Probe zentrifugiert wird, sollte vor Beginn die Temperatur im Inneren der Zentrifuge mit der Temperatur der Probe übereinstimmen. Man kann allerdings auch andere Wege finden den Rotor zu kühlen.

Unmittelbar vor Beginn des Zentrifugierens sollte man sich versichern, dass alle Deckel fest und sicher auf den Zentrifugierröhrchen verschraubt sind.

Ausserdem sollte sichergestellt werden, dass jede Probe mit einer direkt gegenüberliegenden Probe gleichen Gewichts ausgeglichen ist.

Wenn nur eine Probe zu zentrifugieren ist, sollte eine zweite Probe vorbereitet werden, die als Gegengewicht eingesetzt werden kannk.

Drei Proben kann man auch als Dreieck anordnen, so dass die Proben gleich voneinander entfernt sind.

Der Gewichtsausgleich in einer Zentrifuge ist extrem wichtig. Rotoren erreichen sehr hohe Geschwindigeiten und damit kinetische Energien. Bei ungenauem Gewichtsausgleich kann die gesamte Zentrifuge aus ihrem Platz ausbrechen und dabei schwere Schäden verursachen.

Nachdem man nachschaut, dass der Rotor und der Deckel der Zentrifuge gesichert sind, kann man die Zentrifuge anschalten. Es ist empfehlenswert in der Nähe der Zentrifuge zu bleiben, bis die gewünschte Geschwindigkeit erreicht ist. Bei Problemen sollte man immer einen erfahrenen Labormitarbeiter um Hilfe bitten.

Wenn der Zentrifugationsprozess abegeschlossen ist, sollte man an der Unterseite des Zentrifugierröhrchens das Pellet sehen, dass sich aus der uebriggebliebenen Flüssigkeit, oder Überstand, abgesetzt hat.

Der Überstand kann durch Dekantieren entfernt werden. Dekantieren ist ein kompliziertes Wort für Abgießen. Der Überstand kann auch aspiriert werden, was ein kompliziertes Wort für Absaugen ist.

Die aufbereiteten Proben können dann wieder in Lösung gebracht werden. Diesen Prozess nennt man Resuspendieren. Das Wiederholen von Zentrifugieren, Aspirieren und Resuspendieren in Pufferlösung nennt man das Waschen von Zellen.

Nun das wir uns mit den Prinzipien des Zentrifugierens auseinandergesetzt haben, ist es Zeit das wir uns anschauen welche verschiedenen Arten von Zentrifugen es gibt und welche Experimente man damit machen kann.

Festwinkelzentrifugen mit zentral montierten Antriebswellen sind die am häufigsten verwendeten Zentrifugen. Viele Tischzentrifugen fallen in diese Kategorie.

Zentrifugen in denen die Proben mit konstantem Winkel und Position zentrifugiert werden, werden oft für Differenzialzentrifugationsprotokolle genutzt. Bei diesen Protokollen werden mehrere Zentrifugierschritte mit verschiedenen Geschwindigkeiten durchgeführt, um zum Beispiel biologische Proben wie Tierzellen aufzubereiten. Normalerweise braucht man dabei auch mehrere Waschschritte.

Im Gegensatz zu Festwinkelzentrifugen haben Zentrifugen mit Ausschwingrotor flexibele Röhrchenhalterungen, die erlauben das sich Proben unter dem Einfluss der Zentrifugalkraft nach außen bewegen. Diese Art von Rotoren sind besonders für Proben die sich durch Zentrifugieren in bestimmte Schichten abtrennen geeignet. Diese Zentrifugtionsart wird häufig angewendet um verschiedene Zellarten oder Zellorganellen voneinander zu trennen.

Die Ultrazentrifuge ist der große Bruder aller Zentrifugen, die man im Labor antrifft. Eine Ultrazentrifuge kann mit mehr als 70000 rpm zentrifugieren. Dadurch kann man sehr kleine Substanzen, wie zum Beispiel DNA der Viren, isolieren.

Wegen der hohen Geschwindigkeiten sollte man besonders genau auf den Gewichtsausgleich achten und sicherstellen sowohl der Rotor als auch der Schraubverschluss gesichert sind.

Das war die Einführung in die Zentrifugation von JoVE. In diesem Video haben wir gelernt was eine Zentrifuge ist und wie sie funktioniert, wie man eine Zentrifuge bedient, welche Sicherheits und Vorsichtsmaßnahmen man zu beachten hat, und für welche Anwendungen sich welche Zentrifugen eignen. Danke für eure Aufmerksamkeit und vergesst nicht eure Zentrifugenröhrchen durch ein Gegengewicht auszugleichen!

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