Reacciones de ligadura de ADN

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Summary

En biología molecular, la ligadura se refiere a la Unión de dos fragmentos de ADN mediante la formación de un enlace fosfodiéster. Una enzima conocida como una ligasa cataliza la reacción de ligadura. En la célula, ligasas reparación de roturas del filamento solo y doble que se producen durante la replicación del ADN. En el laboratorio, ligase de la DNA se utiliza durante la clonación molecular para unir fragmentos de ADN de insertos con vectores – las moléculas de ADN del portador que se reproducen fragmentos del destino en los organismos de acogida.

Este video proporciona una introducción a la ligadura de la DNA. El principio básico de la ligadura se describe así como un procedimiento paso a paso para configurar una reacción generalizada de la ligadura. Se discuten los aspectos más importantes de las reacciones de ligadura, como cómo la longitud de una proyección final pegajoso afecta la temperatura de reacción y cómo la proporción de ADN coloca a vector debe ser adaptados para prevenir uno mismo-ligadura. Herramientas moleculares que ayudan con trompas como la fosfatasa alcalina fragmento Klenow y camarón (SAP) se mencionan, y aplicaciones como trompas de proximidad y la adición de conectores a los fragmentos de la secuencia también se presentan.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Métodos Básicos en Biología Celular y Molecular. Reacciones de ligadura de ADN. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

La ligadura puede definirse como el acto de Unión y en biología, que el término se refiere a una reacción enzimática que se une a dos biomoléculas con un enlace covalente. Este video describe la aplicación de ligadura de ADN en la investigación de la biología molecular.

En la célula, ligasas del ADN son enzimas que identifican y sellan roturas en el ADN, catalizando la formación de enlaces fosfodiéster entre los grupos hidroxilo 3' y 5'-fosfato de la espina dorsal de la DNA. La ligadura se produce como parte de procesos celulares normales, como la replicación del ADN, para reparar roturas de DNA filamento solo y doble.

En el laboratorio, ligasas de ADN se utiliza rutinariamente en la clonación molecular - un proceso que une endonucleasa digiere fragmentos de ADN, o insertos, con un vector de endonucleasa digiere, como un plásmido, por lo que el fragmento puede ser introducido en las células del huésped y entonces reproducido.

Digestión de la endonucleasa implica el uso de endonucleasas de restricción, o enzimas de restricción, que crear nicks en tramos específicos de ADN.

Estos nicks pueden parecerse a la hebra se rompe produciendo 3' y 5' salientes, llamados extremos pegajosos o doble cadena rompe con sin voladizos, llamados extremos romos. La ligadura de los extremos pegajosos es ventajosa, porque los pares de base sobresaliente cortesía estabilizar la reacción. Porque trompas de extremo romo no tienen ningún emparejamiento base gratuitos, la ligadura es menos eficiente y más difícil para la enzima a unir los extremos. Extremos pegajosos y contundentes no pueden, en circunstancias normales, se unen juntos.

Sin embargo, el fragmento de Klenow, el producto de la ADN polimerasa 1, digerido con subtilisin puede convertir extremos pegajosos para blunt extremos. Klenow posee 3' a 5' actividad exonucleasa que mastica hasta 3' aleros y voladizos de actividad polimerasa que embota 5' extendiendo el extremo 3' de la hebra complementaria.

Cuando el objetivo es insertar un gen en un plásmido, resellado de ADN vector, llamado uno mismo-ligadura, es un resultado indeseable común para una reacción de ligadura. Fosfatasa alcalina tratamiento de digestión posterior de ADN vector elimina 5' fosfatos en ambos extremos y evita que este indeseable resultado.

Como mencionamos anteriormente, DNAs vector y el inserto son digeridos con endonucleasas antes de comenzar con una ligadura. Después de gel-purificación del vector digerido y de inserción, se miden las concentraciones de ADN un espectrofotómetro para determinar la concentración del vector purificado e insertar.

De esta concentración, el número de moléculas de insertar o vector de 1 μl puede determinarse basado en el peso molecular promedio de un par de base de ADN y el número de pares de bases en cada fragmento. Basado en la concentración molecular calculada de vector y el inserto, un 3 a 1 relación de inserto vector se calcula, para determinar el volumen del vector y del inserto utilizados en la reacción. Este 3 a 1 cociente de ADN insertar a vector es deseable, porque sube la probabilidad de que el inserto está ligada en vector versus vector ligadura de sí mismo.

Ahora que han determinado la cantidad de vectores e insertar ADN en la reacción, se procede a configurar la reacción de la ligadura en el hielo. El orden de la adición en que reacción de componentes se deben agregar a su tubo de microcentrífuga es como sigue: estéril suficiente para una marca de agua un volumen final de 10 μl, en nuestro caso usaremos 4 μL, 1 μl de 10 X de buffer de ligadura, 1 μl de 10mM de ATP , 1 μl de vector y 3 μl insertar ADN, como calculado y finalmente 1 μl ADN ligasa. La reacción se mezcla completamente, centrifugada y se incuban a la temperatura adecuada.

Si haces una ligadura del extremo pegajoso o embotado afecta la temperatura y la duración de la reacción de ligadura. Por ejemplo, la ligadura de un extremo pegajoso con una proyección de seis pares puede realizarse cerca de temperatura ambiente durante aproximadamente 1 hora, porque los extremos complementarios estabilizan la Unión de fragmentos. Voladizos cortos o trompas de extremo romo deben llevarse a cabo entre 14-20 ° c durante la noche.

Ahora que hemos aprendido cómo establecer una reacción de la ligadura, echemos un vistazo a algunas de las aplicaciones de este procedimiento.

Trompas se pueden utilizar para insertar directamente fragmentos amplificados por PCR en plásmidos lineal. Aquí se puede apreciar un investigador toma una muestra de cerebro de ratón congelado, aislamiento de ADN genómico de él y luego someterlo a bisulfito de PCR, que es un método basado en PCR para detectar ADN metilado. Productos de PCR entonces se unen directamente en el plásmido para crear una biblioteca de genes que están metiladas en esa región particular del cerebro.

Trompas se pueden utilizar para fijar conectores de oligonucleótidos, que contienen sitios de Unión para primers PCR, para purificar fragmentos de ADN. Cuando se trabaja con muestras tumorales, los científicos pueden utilizar este enfoque para la secuencia de ADN genómico del tumor, con la esperanza de identificar las mutaciones que causan el tumor.

En este video, la ligadura se realiza en la DNA aislada de formaldehído fija las células y posteriormente tratadas con enzimas de restricción y klenow en presencia de la biotina, que se utiliza para tirar hacia abajo de ADN ligado. Esta DNA entonces se amplifica mediante PCR y los productos ordenados para identificar las interacciones de la cromatina en varias escalas como se muestra.

Ahora que has aprendido acerca de ligase de la DNA, varios principios involucrados en establecer la ligadura en el laboratorio, posibles problemas y soluciones y diversas aplicaciones de la ligadura en la investigación de la biología molecular. Gracias por ver.

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