Resúmenes de la enzima de la restricción

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology
 

Summary

Enzimas de restricción o endonucleasas reconocen y cortan el ADN en una secuencia específica. Estas enzimas se producen naturalmente en bacterias como una defensa contra bacteriófagos - virus que infectan bacterias. Bacteriano enzimas de restricción cortan el DNA de bacteriófagos invasores dejando el ADN genómico bacteriano ileso debido a la adición de grupos metilo.

Este video explica los principios básicos de las enzimas de restricción incluyendo: cómo se nombran las enzimas de restricción y los tipos de sitios de reconocimiento y proyecciones que existen. También es un procedimiento generalizado paso a paso de cómo configurar un repertorio de restricción incluyendo los componentes necesarios, el orden en el que la mezcla debe ser montada, y la temperatura de incubación típico y tiempo. Se menciona la importancia de enzimas inactivadoras de restricción para evitar que la actividad estrella. También se ofrecen consejos para realizar resúmenes de enzimas múltiples y uso de controles en las reacciones de la digestión.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Métodos Básicos en Biología Celular y Molecular. Resúmenes de la enzima de la restricción. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Enzimas de restricción o endonucleasas de restricción se utilizan en una variedad de diferentes aplicaciones en biología molecular. Estas enzimas reconocen y unirse a una secuencia específica de ADN, llamada un sitio de restricción. El video que está a punto de ver proporciona alguna información sobre estas moléculas milagrosas y muestra cómo configurar una síntesis de la enzima de la restricción.

¿Dónde las enzimas de restricción viene de todos modos? Estas enzimas pasan a ser una adaptación de las bacterias que actúan como un mecanismo de defensa contra virus conocidos como bacteriófagos. Gracias a la adición de grupos metilo a los sitios de enzimas de restricción en el ADN bacteriano, las enzimas de restricción sólo reconocer y cortar el phage de la DNA, evitando la infección.

Enzimas de restricción tienen algunos nombres bastante raros. Por ejemplo, HindIII, NotI, EcoRI y BamHI. Las tres primeras letras del nombre de una enzima de la restricción se refiere al organismo del que fue aislado. Por ejemplo, la enzima de restricción EcoRI fue aislada de e. coli. La cuarta letra, si es necesario, se refiere a la cepa bacteriana de la cual la enzima se aisló. El número romano indica que sea el primero, en segundo lugar, en tercer lugar, enzima aislada de ese organismo particular.

Enzimas de restricción reconocen una secuencia de nucleótidos, generalmente cuatro a ocho pares bajos largo, llamada un sitio de reconocimiento. En nucleótidos específicos dentro de la secuencia, la enzima rompe los enlaces fosfodiéster en la espina dorsal de la DNA. Los sitios de reconocimiento están generalmente palindrómico, lo que significa que el mismo lee la secuencia hacia delante y hacia atrás. Cuando el palíndromo se encuentra en filamentos complementarios de la molécula de ADN se llama un palíndromo de repetición invertida.

Enzimas de restricción pueden dejar diferentes tipos de extremos una vez que el ADN es hendido: extremos pegajosos y extremos embotados. Extremos pegajosos dejan 3' y 5' voladizos extremos embotados dejan sin voladizos. El tipo de final dicta cómo el fragmento de ADN aislado por la síntesis de enzimas de restricción se se recombinan con otros fragmentos de ADN en un proceso conocido como ligadura.

Una síntesis de la enzima de la restricción debe ser cuidadosamente planificada. Una reacción de digestión por lo general consiste en lo siguiente: agua desionizada, el ADN que va a ser cortado, búfer específico de la enzima se utiliza, y a veces una proteína llamada albúmina de suero bovino o BSA. BSA estabilizará la reacción impidiendo que la enzima pegarse al lado del contenedor que alberga el resumen. Cada enzima de restricción puede tener potencialmente buffer diferentes condiciones, temperaturas de incubación y requisitos de BSA. Proveedores de enzimas de restricción tendrá recursos que uno puede verificar para obtener toda la información necesaria.

Para empezar a configurar el Resumen, recuperar la enzima de restricción en el congelador o nevera. Mantenga la enzima de restricción en hielo o en un envase resistente a la termal para asegurarse de que existe una actividad óptima para las reacciones futuras. A un tubo de microcentrífuga componentes de la reacción se deben agregar en el siguiente orden. En primer lugar, un volumen de agua estéril, libre de nucleasas que producirá un volumen de reacción final de 20μL. Entonces 10 x Buffer de la enzima de la restricción, entonces BSA si es necesario, hasta 1μg de DNA y 2-10 unidades de enzima. Las unidades se definen como la cantidad de enzima necesaria para producir una completa recopilación de 1μg de control ADN en 60 minutos a 37° C en un volumen de reacción de 50μL. Después, mezclar con un vórtex y posteriormente centrifugar brevemente a 12, 000xg en una microcentrífuga para recoger el contenido en la parte inferior del tubo. Luego incubar a una temperatura óptima para su enzima de la restricción, generalmente 37 º C en un bloque de calentamiento durante 1 a 4 horas.

Una vez que ha terminado su digestión, es una buena idea para incubar la mezcla de reacción a 65 ° c para calor inactivar las enzimas de restricción. Mientras que las enzimas de restricción cortan site-specifically mayoría de las veces, tiempos de incubación prolongados pueden conducir a la actividad, que es cortar en sitios que son similares, pero distintos de sus sitios de digestión típica de estrella.

Después de la inactivación, se debe ejecutar el ADN en un gel de agarosa para que el compendio era acertado.

Aquí hay un par de consejos utiles para correr tus resúmenes y garantizar el éxito.

A veces puedes encontrarte en una situación donde es necesario utilizar para generar un fragmento específico de ADN enzimas. En este caso necesitará comprobar que condiciones de buffer y temperaturas de incubación son compatibles entre las dos enzimas, si por lo tanto, realice un resumen doble y han cortado ambos enzimas en la misma reacción. A veces, sin embargo, usted encontrará incompatibilidad en las condiciones de reacción entre las dos enzimas, y en este caso la solución consiste en utilizar las enzimas secuencialmente. Por ejemplo, la recopilación puede realizarse primero con una enzima, y entonces se puede alterar la composición del tampón, para que sea óptimo para la segunda enzima. Otra manera de superar la incompatibilidad del almacenador intermediario y realizar un resumen secuencial es purificar el ADN después de la recopilación inicial y llevar a cabo el segundo Resumen.

Uso de controles son una buena manera de entender por qué un resumen podría ir mal. Por ejemplo, no hay control de la enzima le permitirá comprobar la integridad de la muestra de ADN y determinar si existe actividad de exonucleasa. El uso de control de ADN con sitios de restricción conocido permite la actividad de la enzima a ser probado.

Ahora que hemos visto cómo se realizan resúmenes, permite echar un vistazo a varias maneras puede utilizar enzimas de restricción.

Enzimas de restricción pueden utilizarse de diagnóstico, para identificar las muestras particulares. Un resumen de la carga en un chip especializado y luego colocando ese chip en una máquina llamada un bioanalyzer. Los investigadores pueden analizar tamaños de fragmento de ADN, producidos por la digestión, con el fin de determinar la autenticidad de las muestras de pescado. Los patrones de bandas diferentes del mismo gen de una especie o especies diferentes en este caso, se llaman polimorfismos de longitud de fragmento de restricción.

Enzimas de restricción pueden utilizarse también en subcloning aislar un fragmento de ADN de un plásmido e insertar en otro, por lo que el fragmento deseado puede repetirse utilizando bacterias.

Empleando la reacción en cadena de polimerasa, o PCR para introducir genes en localizaciones muy específicas de sitios de restricción, enzimas de la restricción puede utilizarse para determinar la presencia de diferencias de un solo nucleótido en formas alternativas del mismo gen o alelo. Estos polimorfismos de nucleótido único, o SNP, es difícil de detectar con la polimerización en cadena y solo de la electroforesis del gel. Con la introducción del sitio de restricción en el SNP, un simple digest puede distinguir entre los alelos.

Sólo has visto video de Zeus sobre enzimas de restricción. Has aprendido de dónde provienen estas enzimas, han enseñado algunos conceptos básicos sobre cómo funcionan, visto cómo configurar un resumen y aprendido cómo se puede utilizar enzimas de restricción en biología molecular. ¡Como siempre, gracias por ver!

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