Isolation des acides nucléiques à partir de la levure

Biology I

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Summary

L’un des nombreux avantages de l’utilisation de la levure comme système modèle est que de grandes quantités de biomacromolécules comprenant les acides nucléiques (ADN et ARN) peuvent être purifiées à partir de cultures cellulaires.

Cette vidéo portera sur les étapes requises pour effectuer une extraction d’acides nucléiques. Nous commencerons par donner un bref aperçu de la culture, de la récolte et de la lyse de cellules de levure qui sont les étapes initiales communes à l’isolation de toute biomacromolécule. Nous discuterons ensuite de deux méthodes de purification propres à la séparation d’acides nucléiques : la colonne d’affinité et la séparation de phase. Nous présenterons également plusieurs applications de ces méthodes en laboratoire, notamment la préparation d’acides nucléiques pour les techniques de biologie moléculaire comme la PCR et le Southern blot, la quantification de l’expression de gènes en réponse à des stimuli environnementaux, et la purification de grandes quantités de protéines recombinantes.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Les organismes modèles I : la levure, la Drosophila et le C. elegans. Isolation des acides nucléiques à partir de la levure. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Aujourd’hui, nous allons vous présenter la façon de purifier des acides nucléiques à partir de la Saccharomyces cerevisiae, également connue comme levure de boulanger. Les acides nucléiques peuvent inclure l’ADN et l’ARN. Cette vidéo discutera de l’isolation de ces molécules à partir des cellules de levure par séparation de phase et chromatographie..

Bien qu’il existe de nombreuses méthodes de purification des acides nucléiques de la levure, la plupart de ces méthodes commencent par les mêmes étapes.

Les cellules de levure sont premièrement multipliées en prélevant une seule colonie sur une plaque de gélose et en l’inoculant sur un milieu de culture YPD. Le mélange doit être cultivé une nuit à 30 °C dans un incubateur orbital ou rotatif.

Les cellules de levure doivent être récoltées au milieu de la phase exponentielle de la courbe de croissance afin d’optimiser le rendement. La densité optique ou DO mesurée à une longueur d'onde de 600 nm est généralement comprise entre 0.5 et 1 lors de la phase exponentielle de la croissance des levures. Une fois que les cellules ont atteint une densité optique adéquate, celles-ci sont centrifugées pour former un culot et resuspendues dans une solution tampon de lyse afin de briser les cellules.

L’un des aspects les plus difficiles de l’isolation d’acides nucléiques de levure est la rupture de ses parois cellulaires résistantes. Les parois cellulaires peuvent être détruites par une combinaison de techniques enzymatiques et physiques. La destruction de la paroi cellulaire provoque la formation par la levure de cellules sphéroïdes appelées sphéroplastes, cellules qui peuvent être détruites par les techniques courantes de lyse.

Les sphéroplastes sont normalement détruits par des détergents tels que le dodecylsulfate de sodium ou SDS, qui désintègre les membranes cellulaires. Les cellules peuvent également être homogénéisées. Par exemple, des billes de verres peuvent être ajoutées aux cellules et les cellules homogénéisées par vortex. Les parois cellulaires peuvent également être rompues par ultrasons en utilisant un sonicateur pour favoriser le processus de lyse.

Comme indiqué précédemment, toutes les procédures de purification d’acides nucléiques de levure ont des étapes similaires pour la multiplication, le prélèvement et la lyse de cellules de levure. Cependant, une fois les cellules lysées, plusieurs méthodes peuvent être employées pour isoler les acides nucléiques. Les acides nucléiques peuvent être purifiés en utilisant une colonne d’affinité ou par séparation de phase.

Le meilleur moyen d'isoler l’ADN et l’ARN est d'utiliser leur fixation sur colonne de silice. Les acides nucléiques se fixent sur la colonne par échange d’anions et peuvent être élués hors de la colonne une fois séparés des autres composés cellulaires.

La séparation de phase se base sur le principe que des solutions possédant des propriétés différentes peuvent être utilisées pour purifier ou concentrer certaines protéines ou acides nucléiques en fonction de leurs solubilités. L’ajout de chloroforme sépare une suspension de composés cellulaires en deux phases distinctes, la phase aqueuse et la phase organique. La phase organique contient les protéines alors que la phase aqueuse contient les acides nucléiques. L’ADN peut alors être précipité à partir de la phase organique par addition d’éthanol.

Les acides nucléiques peuvent être isolés de la levure en suivant un protocole pour colonne d’affinité. Les cellules sont tout d'abord cultivées et récoltées par centrifugation.

Le surnageant est éliminé et jeté alors que le culot cellulaire est remis en suspension dans une solution tampon contenant une enzyme, agité au vortex, et incubé jusqu’à la digestion des parois cellulaires. La digestion des parois cellulaires et la formation de sphéroplastes peuvent être vérifiées au microscope lors de l’optimisation du traitement enzymatique. Après la digestion des parois cellulaires, un tampon de lyse est ajouté aux cellules et le mélange agité au vortex.

Les cellules lysées doivent être centrifugées pour éliminer les débris du mélange, laissant un surnageant contenant l’ADN, les petites particules et les protéines solubles. Après une centrifugation qui élimine la majorité des impuretés solubles, le surnageant est déposé sur une colonne de silice et les acides nucléiques peuvent alors s'y lier.

Les étapes de lavages sont effectuées avec de l’éthanol ou une solution tampon à forte concentration en sels pour éliminer les impuretés résiduelles des acides nucléiques adsorbés. L’ADN ou l’ARN est finalement élués avec de l’eau ou une solution tampon à faible teneur en sel. Assurez-vous d’utiliser une solution tampon ou de l’eau exempte d’enzymes ADNase ou ARNase.

Les acides nucléiques isolés à partir de la levure ont une variété d’utilisations suivant votre objectif expérimental spécifique. L’ADN isolé à partir de la levure peut être utilisé dans de nombreuses techniques de biologie moléculaire comprenant la PCR, la Southern Blot ou la digestion par enzyme de restriction.

Des changements dans l’expression de gènes peuvent être identifiés par un procédé connu sous le nom d'analyse par micro-réseaux, procédé qui utilise des réseaux de gènes comme celui-ci.

Si nous avons deux cultures de levure, l’une exposée au peroxyde d’hydrogène et l’autre étant notre contrôle, l’ARNm peut être isolé à partir de ces cultures et hybridé sur lamelles de micro-réseaux. Les lamelles sont analysées, et les gènes modifiés par stress oxydatif peuvent être identifiés.

Dans cette vidéo, les chercheurs utilisent un système robotisé pour préparer une banque de mutants de levure à l’échelle du génome, mutants utilisés pour l’évaluation de la fonction des gènes. Grâce à l’insertion dans les gènes de séquences spécifiques appelées marqueurs génétiques, l’ADN génomique des souches de mutants peut être simultanément extrait à partir des 4,000 à 6,000 individus et soumis à l'analyses par micro-réseaux ou au séquençage. En fonction de l'abondance relative des marqueurs, le potentiel de chaque mutant peut être déterminé suivant de multiples conditions expérimentales.

Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur l’isolation des acides nucléiques à partir de la levure. Vous devriez maintenant comprendre les principaux aspects de la purification des acides nucléiques tels que la façon de préparer des cellules de levure pour la lyse ou d'effectuer différentes procédures d’extraction et d’isolation. Comme toujours, merci de votre attention!

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