Electroporation in ovo d'embryons de poulet

Biology II

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Summary

L'électroporation est une technique utilisée dans la recherche biomédicale qui permet la manipulation de l'expression de gènes par l'intermédiaire de la livraison de matériel génétique étranger dans les cellules. Plus précisément, l'électroporation in ovo est effectuée sur des embryons (Gallus gallus domesticus) dans leurs coquilles à des stades précoces du développement. Lors de cette procédure, de l'ADN ou des fragments nucléotidiques pour l’inactivation génétique sont d'abord injectés dans un tissu cible. Toutefois, le matériel génétique est incapable de pénétrer la membrane plasmique pour effectuer sa fonction à l'intérieur de la cellule. Pour résoudre ce problème, un champ électrique est appliqué, ce qui provoque des perturbations temporaires, altère la stabilité et crée des pores à travers la membrane plasmique. Ce champ électrique permet également d’attirer les acides nucléiques chargés négativement à migrer vers l'électrode positive, donc de conduire de manière efficace l'ADN ou les fragments nucléotidiques pour l’inactivation génétique dans la cellule. L'avantage majeur de cette technique est l’administration de matériel génétique de façon localisée à des groupes de cellules, à des moments spécifiques du développement. Par conséquent, les mécanismes génétiques qui régissent les évènements du développement peuvent être examinés.

Cette vidéo donne un aperçu des principes sous-jacents à l'électroporation in ovo et présente les outils nécessaires pour exécuter cette technique, y compris la fabrication d’aiguilles pour micropipettes, le placement des électrodes et l’exécution de l’électroporation. Le protocole présente les étapes nécessaires pour l’exécution de cette procédure avant d’introduire quelques exemples fascinants qui démontrent comment cette technique est utilisée pour effectuer une variété de manipulations génétiques sur des embryons de poulet.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Les organismes modèles II : La souris, le poisson-zèbre et le poussin. Electroporation in ovo d'embryons de poulet. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

L'électroporation est une technique utilisée pour introduire un matériel génétique exogène dans des cellules. L’électroporation d'embryons de poulet réalisée à l'intérieur de l'œuf, ou in ovo, est un outil précieux pour les biologistes du développement, car la livraison de matériel génétique peut être localisée dans des tissus spécifiques et à des moments spécifiques du développement. Cette vidéo présente les principes de base d’électroporation in ovo, décrit les étapes essentielles de la procédure, et discute de la façon dont cette technique peut être utilisée pour étudier les processus biologiques au cours du développement.

Pour commencer, passons en revue les principes de base de l'électroporation pour comprendre comment elle peut être utilisée pour transférer de l'ADN dans une cellule.

Tout d'abord, la micro-injection est utilisée pour délivrer l'ADN en étroite proximité avec une cellule d'intérêt. Cependant, l'ADN ne peut pas pénétrer la membrane plasmique et entrer dans la cellule.

Pour résoudre ce problème, un courant électrique est appliqué pour perturber la stabilité de la membrane, créant des pores. Une seconde conséquence de ce champ électrique, est la migration de l'ADN chargé négativement vers l'électrode positive. Par conséquent, seules les cellules les plus proches de l'électrode positive deviennent transfectées avec l'ADN.

Maintenant que vous connaissez les principes de base, parlons de la préparation des embryons pour l'électroporation. Si vous avez besoin d'utiliser des embryons âgés au-delà du stade 20 selon Hamburger Hamilton, il est préférable de cultiver vos embryons à l’extérieur de la coque, ou ex ovo, pour avoir un accès plus facile aux tissus. Cette vidéo se concentre sur l’électroporation effectuée dans la coquille, ou in ovo, sur des embryons aux stades précoces de développement.

Pour commencer, les œufs doivent être incubés dans un incubateur humidifié à 37 °C, jusqu'à ce qu'ils aient atteint le stade de développement souhaité. Pendant que les œufs incubent, préparer les outils pour l’injection et l'électroporation. Premièrement, fabriquez des-micropipettes en étirant une pipette en verre de 0,5 mm avec une étireuse. Pour ouvrir le bout de la micropipette, placez la micropipette sous un microscope et cassez un petit morceau de la pointe. Ensuite, préparez la solution d'injection, qui devrait contenir une dilution appropriée de l’ADN à l’étude, ainsi qu'un colorant pour vous aider à visualiser la solution injectée.

Attachez l’aiguille à un tuyau souple pour contrôler le mouvement du fluide avec la bouche. L’aiguille peut aussi être connectée à un micro-injecteur, qui produit des changements de pressions d’air réglables. Remplissez la micropipette en immergeant la pointe dans la solution d'injection et appliquez une pression négative.

En plus des aiguilles, vous aurez également besoin d'électrodes. Celles-ci consistent en deux fils dénudés maintenus ensembles par un adaptateur. Une paire de câbles connecte les électrodes au générateur électrique d'impulsions, ou électroporateur, qui contrôle la durée d'impulsion, la fréquence et la tension électrique. Pour un fonctionnement mains libres, l'électroporateur peut être activé par une pédale.

Une fois que les œufs sont prêts, découpez une fenêtre dans la coquille, et ajoutez quelques gouttes de solution saline physiologique, comme celle de Hanks, pour empêcher l'embryon de se dessécher. Au microscope, positionnez l'œuf de telle sorte que le tissu d'intérêt soit accessible à l’aiguille. Ensuite, percez l'embryon avec l’aiguille et délivrez la solution en appliquant une légère pression.

Maintenant que nous avons injecté l’ADN, il est temps d’accomplir l'électroporation. Placez les électrodes de sorte qu'elles soient immergées dans la solution de Hank et que le tissu d'intérêt soit centré entre les deux électrodes. Afin d'appliquer le courant électrique, appuyez sur la pédale et observez les bulles se formant autour des électrodes.

Une fois l'électroporation terminée, retirez les électrodes et essuyez les avec une solution d’éthanol à 70%. Ajoutez quelques gouttes de solution saline avec un supplément d'antibiotiques pour prévenir l'infection, et refermez la fenêtre avec du ruban adhésif. Enfin, replacez les œufs dans l'incubateur pour continuer leur développement avant d'analyser leur phénotype.

Maintenant que nous savons tout au sujet de l'électroporation in ovo, regardons quelques exemples d’application de cette technique par les scientifiques, dans la recherche développementale.

Pour commencer, l'électroporation peut être utilisée pour bloquer l'expression de gènes par la livraison de séquences nucléotidiques pour l’inactivation génétique. Dans cet exemple, les cellules du tube neural en développement ont été soumises à une électroporation avec un fragment d’acide nucléique pour l’inactivation génétique. Les embryons se sont développés, puis les trajectoires axonales furent comparées entre les échantillons normaux et ceux après l’inactivation génétique pour évaluer le contrôle génétique sur le guidage axonal.

A l'inverse, l'électroporation in ovo peut également être utilisée pour exprimer une protéine dans un sous-groupe de cellules, par l'introduction d'un plasmide contenant un gène codant les protéines, et un promoteur : une séquence qui lie l’ARN polymérase pour initialiser la transcription. Ici, les chercheurs ont livré un gène seul dans les cellules du cerveau au stade embryonnaire. Le marquage des tissus pour détecter à la fois la protéine produite par ce gène ainsi que les marqueurs de sous-types de neurones spécifiques, montre que le gène électroporé altère le développement neural.

Les fragments d'ADN codant pour des protéines fluorescentes peuvent également être introduits par électroporation afin de visualiser certaines cellules et structures au cours du développement. Cela permet la visualisation en direct de processus complexes, tels que le développement de la moelle épinière, ce qui donne un aperçu de la dynamique des mouvements cellulaires dans le temps.

Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à l'électroporation in ovo, une technique utile pour administrer du matériel génétique dans les embryons de poulet. Cette vidéo a présenté les principes de base de l'électroporation, les étapes nécessaires afin d'injecter et de réaliser l'électroporation, ainsi que des utilisations de cette technique dans la recherche du développement. Merci de nous avoir regardés!

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