Biology

Подготовка одноклеточных суспензий из селезенки мыши с gentleMACS диссоциатор

Published: December 11, 2008 doi: 10.3791/1029

Melanie Jungblut¹, Karen Oeltze¹, Irene Zehnter¹, Doris Hasselmann¹, Andreas Bosio¹

Summary

Это видео описывает простой, экономящий время техника для автоматизированного диссоциации ткани с помощью диссоциатор gentleMACS подготовить одноклеточных суспензий мыши спленоцитов.

Abstract

Single-клеточные суспензии, являются необходимым условием для проведения экспериментов в ячейке разделения, клеточный анализ и клеточных культур. Чтобы избежать утомительного и часто болезненных диссоциации ручной диссоциатор gentleMACS позволяет отделить ткани очень эффективно в контролируемых и воспроизводимых условиях. Диссоциатор gentleMACS может оптимально отделить селезенки мыши, сочетая экономию времени и стандартизации с пользователем безопасности. Это видео описывает, как отделить мыши селезенки использованием gentleMACS диссоциатор, автоматизированных настольный прибор, который может нарушить механически тканей с помощью специальных труб для получения жизнеспособных клеточных суспензий. После диссоциации, селезенки фильтруют, центрифугируют и ресуспендируют для дальнейшего применения.

Protocol

Введение в оборудование

Ткань мягко диссоциированных, используя фиолетовый C Трубы в жизнеспособные одноклеточных суспензий.
PBS / BSA ЭДТА буфер используется для диссоциации клеток. Буфер получают путем добавления 1 часть маточного раствора BSA до 20 частей autoMACS Полоскание раствором, содержащим ЭДТА.
MACS Предварительное разделение Фильтры используются, чтобы диссоциированных образцов тканей свободны от всех клеточных сгустков, способствующих успешному разделения MACS и последующего анализа.

Диссоциирующего клеток селезенки

Всего селезенки являются disscociated в одноклеточных суспензий спленоцитов использованием диссоциатор gentleMACS.
Чтобы начать процедуру, нагрузка труб С с объемом буфера в зависимости от массы селезенки. Здоровой селезенки молодых взрослых самок мышей BALB / с мышь весит около 80-120 мг. Каждый 1 до 2 селезенки этой массы требуют 3 мл буфера. Селезенки от старых животных или животных с инфекциями часто большие и должны быть взвешены в буфере. Буфера тома должны быть расширены соответственно. Не превышать общий объем буфера 10 мл.
Добавить расчлененный селезенки, чтобы труба С, содержащий 3 мл буфера.
Убедитесь, что крышка C Трубка плотно и прикрепите трубы С до диссоциатор с цоколем вниз.
Включите диссоциатор. Для 1-2 селезенки, выберите программу m_spleen_01. Программа займет 56 секунд. Если число селезенки больше, используйте программу m_spleen_04, эта программа может быть использована для до 720 мг ткани селезенки.
После завершения программы нативной ткани селезенки распадается на спленоцитов подвески.
Спином вниз все суспензии клеток в 300xg при комнатной температуре в течение примерно 30 сек. Это гарантирует, что ротор и статор, освобождаются от всех клеток, которые собираются в нижней части трубы C.
Удалить образец через перегородку уплотнением отверстие в крышке трубы С, используя 1000 мкл pipetter.

Фильтрация шаг

Для начала фильтрации шаг, примените диссоциированных тканей предварительного разделения фильтра или ячейки фильтра 30 мкм с размером пор. Фильтр должен соответствовать 15 мл трубки в течение 1-2 селезенки или 50 мл трубки более чем на 2 селезенки.
Пусть клеточной суспензии пройти. Затем промыть фильтр, применяя 5 мл буфера.
Теперь, центрифуги трубы с клеточной суспензии в 300xg, при комнатной температуре в течение 10 минут, чтобы собрать все спленоцитов в осадок клеток селезенки.
Теперь, что у нас есть гранул диссоциированных спленоцитов, мы должны аспирата супернатант и ресуспендируют осадок клеток в соответствующее количество буфера.

Селезенка диссоциации использованием диссоциатор gentleMACS даст высокий процент жизнеспособных спленоцитов, о чем свидетельствует проточной цитометрии с использованием MACSQuant Analyzer. Мертвые клетки окрашиваются по йодида пропидий. В примере, при условии, передней стороне разброс точка графика видно, подготовленные спленоцитов.

Discussion

Чтобы избежать утомительного и часто болезненных диссоциации по эксплуатации, диссоциатор gentleMACS позволяет отделить ткани очень эффективно в контролируемых и воспроизводимых условиях. Процедура ткани диссоциации нежно к клеткам и суспензий дает клетка с высокой скоростью жизнеспособность. Диссоциатор gentleMACS в сочетании с C Трубы предназначены для подготовки одноклеточных суспензий из различных тканей. Прибор оснащен рядом предустановленных программ отделить мыши селезенки, печени, легких или нервной ткани. Ряд программ и протоколов будет постоянно расширена за счет включения дополнительных тканей.

Disclosures

Все протоколы и спецификации доступны на

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
gentleMACS™ Starting Kit	Miltenyi Biotec	130-093-235	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx
13 mL Tubes	Miltenyi Biotec	130-091-596	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_751_13_mL_Tubes_for_LS_Columns.aspx
autoMACS™ Rinsing Solution	Miltenyi Biotec	130-091-222	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx
MACS® BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec	130-091-376	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx
Pre-Separation Filters	Miltenyi Biotec	130-041-407	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx
MACSQuant Analyzer	Miltenyi Biotec	130-092-197
Propidium Iodide Solution	Miltenyi Biotec	130-093-233	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx