Summary
Questo protocollo illustra come eseguire immunoistochimica su sezionato larva di Drosophila.
Abstract
Il
Protocol
Prima di iniziare
- Preparare le seguenti soluzioni: PBT (0,1% Triton X100 in PBS 1X), PBTB (0,2% BSA in PBT), e PBTN (2% in PBTB NGS).
- Sezionare larve di Drosophila. Si prega di consultare Drosophila larvale Dissection NMJ.
Immunoistochimica
- Spostare le larve in una provetta contenente 1,5 ml PBT. Lavare le larve due volte per 15 minuti in PBT. Nota: per lavare, posizionare il tubo di 1,5 ml di un mixer nutator. Asportare il liquido con un pippetor e sostituirlo con il liquido fresco.
- Rimuovere il PBT. Lavare in PBTB due volte per 30 minuti.
- Rimuovere il PBTB. Lavare in PBTN due volte per 15 minuti.
- Incubare in anticorpo primario diluito in PBTN a temperatura ambiente per 1 ora o al 4 º C durante la notte.
- Sciacquare due volte con PBTB. Nota: alla soluzione di risciacquo aggiungere e rimuovere in fretta.
- Lavare due volte per 15 minuti in PBTB.
- Lavare in PBTN per 30 minuti.
- Incubare in anticorpo secondario (e coniugato anticorpo primario se si utilizza uno) diluito in PBTN.
- Copertura in stagnola e incubare per 1,5 ore a temperatura ambiente.
- Sciacquare due volte con PBTB.
- Lavare due volte per 15 minuti con PBTB.
- Procedere al montaggio.
Montaggio
Nota: il Monte in glicerolo se i campioni saranno immediatamente ripreso. Montare a prolungare oro se i campioni saranno conservati prima immagine (per più di una settimana) o se i campioni devono essere ripreso più volte. Per utilizzare, posto una bottiglia di prolungare a 65 ° C bagnomaria per 2-3 minuti. Prelevare un 'aliquota di prolungare oro e di tenere a fuoco-block a 45-50 º C.
- Versare prepara macchiato in PBT per un vetro da orologio.
- Metti un po 'glicerolo su un vetrino pulito per l'elaborazione.
- Spostare gli animali per far scorrere il trattamento con la scelta fuori dal vetro da orologio da un angolo con pinze. Assicurare che siano parte cuticole verso il basso.
- Togliere la testa e la coda con una lama di rasoio fresca sul vetrino di elaborazione. Exacto un coltello con lama # 16 funziona bene per questo.
- Su un altro scivolo (montaggio di diapositive), mettere una piccola goccia di glicerolo / prolungare e stenderlo con una pinza pulita.
- Spostare gli animali sezionati al vetrino di montaggio al loro margine, facendo attenzione a non invertire loro. Prova a montarli in fila con lo stesso orientamento. Monte 6-8 animali per vetrino.
- Caduta di una scivolata sulla copertura mettendo un bordo in glicerolo / Prolungare e lentamente liberando.
- Sigillare la diapositiva con smalto. [Nota Non immagine fino a quando la vernice è asciutta. Questo di solito prende dieci minuti. Per i campioni montati in oro prolungare, lasciate le diapositive asciugare per almeno tre ore prima di chiusura o di immagini.]
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Discussion
Immunoistochimica (IHC) è di vitale importanza per lo studio della biologia NMJ perché consente la visualizzazione delle NMJ. Questo è ottenuto utilizzando anticorpi che riconoscono la membrana neuronale (ad esempio, HRP), il presynapse (ad esempio, CSP, SYT), e / o il postsynapse (ad esempio, DLG). Molecole di segnalazione, proteine strutturali, nuove proteine o di interesse possono anche essere colorati. Poi, i geni possono essere mutati o missexpressed e IHC in grado di rilevare perturbazione di struttura sinaptica e / o di segnalazione neuronali.
Il NMJ di Drosophila ha guadagnato grande popolarità da quando i primi studi che illuminava la sua struttura di base e la funzione. 1-4 Molte delle molecole che sono stati identificati in studi di NMJ Drosophila sono conservati nei vertebrati. 4 Perciò, le intuizioni appreso attraverso gli studi del NMJ Drosophila possono essere applicabili alla biologia sinaptica in molti sistemi. Alcune applicazioni possibili includono lo studio di molecole coinvolte nello sviluppo sinaptica, plasticità, e le malattie neurologiche.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope “Stemi” 2000 | Carl Zeiss, Inc. | 495101-9804-000 | |
| Light Source KL 1500 LCD | Carl Zeiss, Inc. | 000000-1063-181 | |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Adams™ Nutator Mixer | BD Biosciences | 421105 | |
| No.1 Precision knife | X-Acto | 3201 | |
| No. 16 Blades | X-Acto | 216 | |
| ProLong Gold Antifade reagent | Invitrogen | 36930 |
References
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
- Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae. J Neurosci. 9, 710-725 (1989).
- Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).
- Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).
