Imagens de células vivas é de utilidade particular quando se estuda a dinâmica do tráfico organela. Aqui nós descrevemos um protocolo para geração de imagens ao vivo de vesículas com núcleo denso em neurônios cultivados com grande campo de microscopia de fluorescência. Este protocolo é flexível e pode ser adaptado para outras organelas imagem, tais como mitocôndrias, endossomos, e peroxissomos.
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Artigo de método
Imagens ao vivo de vesículas com núcleo denso na Primária Cultivadas neurônios do hipocampo
Neste artigo
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Resumo
Resumo
Observação e caracterização dinâmica processos celulares podem fornecer informações importantes sobre a atividade celular que não pode ser adquirida a partir de imagens estáticas. Vital sondas fluorescentes, particularmente proteína fluorescente verde (GFP) revolucionaram a biologia celular decorrentes da capacidade de rótulo específico compartimentos intracelular e estruturas celulares. Por exemplo, a imagem ao vivo da GFP (e suas variantes espectral) quimeras têm permitido uma análise dinâmica do citoesqueleto, transporte organela, ea dinâmica da membrana em uma infinidade de organismos e tipos celulares [1-3]. Apesar de imagens ao vivo tornou-se predominante, essa abordagem ainda apresenta muitos desafios técnicos, particularmente no ensino primário neurônios cultivados. Um desafio é a expressão de proteínas GFP na pós-mitóticas neurônios, o outro é a capacidade de capturar imagens fluorescentes, minimizando fototoxicidade, fotodegradação, e manter a saúde das células em geral. Aqui nós fornecemos um protocolo que descreve um método de transfecção lipídica baseado em que produz uma taxa de transfecção relativamente baixo (~ 0,5%), porém, é ideal para a imagem de neurônios totalmente polarizada. A taxa de transfecção baixo é essencial para que os axônios e dendritos só pode ser caracterizada como a sua orientação para o corpo celular para confirmar a direcionalidade de transporte, ou seja, v. anterógrada retrógrada. A nossa abordagem à imagem GFP expressar neurônios depende de um microscópio de campo amplo fluorescente padrão equipado com uma câmera CCD, software de captura de imagem, e uma câmara de imagem aquecida. Temos imaged uma grande variedade de organelas ou estruturas, por exemplo, com núcleo denso vesículas, mitocôndrias cones, crescimento e actina, sem qualquer ótica ou requisitos especiais de excitação que não seja uma fonte de luz fluorescente. Além disso, espectralmente distintas, as proteínas etiquetadas fluorescente, por exemplo, GFP e dsRed marcadas proteínas, podem ser visualizados simultaneamente perto de caracterizar co-transporte ou outros eventos coordenados celular. A abordagem de imagem aqui descrito é flexível para uma variedade de aplicações de imagem e pode ser adotado por um laboratório de custo relativamente pouco desde um microscópio está disponível.
Protocolo
Parte 1: Transfecção de neurônios utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen)
Equipamentos de set-up:
Rato ou camundongo neurônios do hipocampo são cultivadas de acordo com Kaech e Banker, 2006 [4]. A densidade celular mais utilizados para a transfections é de 250.000 prato cells/6-cm. Reagentes e equipamentos necessários incluem 50 mM de ácido cinurênico, suporte para tubos regulares de bancada, um refrigerador de bancada (o melhor para manter frio reagente Lipofectamine),
Reagente Lipofectamine, MEM, tubos de micropipetters e pinças esterilizadas.
Procedimento:
- Para ca....
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Discussão
Imagens de células vivas é uma técnica difícil, mas poderosa para a observação direta de organela transporte em neurônios cultivados. Podem surgir dificuldades com a montante do procedimento com pobre saúde neurônio devido a complicações cultura. Portanto, a saúde da célula (para exemplos, ver ref. 4) devem ser avaliadas antes e após a transfecção, observando as lamelas, enquanto em meio de crescimento usando um tecido microscópio de luz cultura. O processo de transferência dos neurônios contendo lamínulas para a câmara.......
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Agradecimentos
Agradecemos a Harald Hutter e Helena Decker para a sua leitura cuidadosa deste manuscrito. Agradecemos também Reg Sidhu da Leica Microsystems por sua perícia técnica. Esta pesquisa foi apoiada pelo Conselho Nacional e Ciências de Engenharia do Canadá, Prêmio # 327100-06, eo Simon Fraser University Faculty of Science.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários | |
|---|---|---|---|---|
| MEM-Eagle com sais de Earle e L-glutamina | Reagente | Mediatech, Inc. | 10-010-CV | |
| Lipofectamina 2000 | Reagente | Invitrogen | 11668-027 | Reagente de transfeção |
| Hanks 10X com Ca2+ e Mg2+ | Reagente | GIBCO, por Life Technologies | 14185-052 | Meio para imagem em tempo real |
| HEPES 1M | Reagente | GIBCO, por Life Technologies | 15630-130 | Meio para imagem em tempo real |
Referências
- Kulic, I. M., et al. The role of microtubule movement in bidirectional organelle transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (29), 10011-10016 (2008).
- Jacobson, C., Schnapp, B., Banker, G. A. A change in the selective trans....
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Reimpressões e permissões
Errata
Formal Correction: Erratum: Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons.
Posted by JoVE Editors on 1/20/2010. Citeable Link.
A correction was made to Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons. There was an error in the author's name. The author name was corrected to include a middle initial as follows:
David M. Kwinter, Michael A. Silverman
instead of:
David Kwinter, Michael Silverman.
