Live-Imaging van dicht-core Blaasjes in het jeugdwerk Gekweekte hippocampale neuronen

Summary

Live-cell imaging is met name van nut bij het bestuderen van de dynamiek van organel mensenhandel. Hier beschrijven we een protocol voor live beeldvorming van dense-core blaasjes in gekweekte neuronen met behulp van wide-field fluorescentie microscopie. Dit protocol is flexibel en kan worden aangepast aan image andere organellen, zoals mitochondriën, endosomen, en peroxisomen.

Abstract

Observeren en karakteriseren van dynamische cellulaire processen kan belangrijke informatie opleveren over cellulaire activiteit die niet kan worden verkregen uit statische afbeeldingen. Vital fluorescerende probes, in het bijzonder groen fluorescerend eiwit (GFP) hebben een revolutie teweeggebracht in de celbiologie die voortvloeien uit de mogelijkheid om specifieke intracellulaire compartimenten en cellulaire structuren label. Zo hebben de live beeldvorming van GFP (en de spectrale varianten) hersenspinsels toegestaan ​​voor een dynamische analyse van het cytoskelet, organellen transport, en membraan dynamiek in een veelheid van organismen en celtypes [1-3]. Hoewel de live-imaging is geworden gangbaar, deze aanpak brengt nog veel technische uitdagingen, met name in de eerste gekweekte neuronen. Een uitdaging is de uitdrukking van GFP-gemerkte eiwitten in de post-mitotische neuronen, de andere is de mogelijkheid om fluorescerende beelden vast te leggen terwijl het minimaliseren van fototoxiciteit, fotobleken, en onderhouden van de algemene gezondheid van de cellen. Hier hebben we een protocol dat een lipide-gebaseerde transfectie methode die een relatief lage transfectie tarief (~ 0,5%) geeft een beschrijving, maar is ideaal voor de beeldvorming van volledig gepolariseerd neuronen. Een lage transfectie zijn essentieel, zodat een axonen en dendrieten kan worden gekenmerkt als hun oriëntatie op de cel lichaam gerichtheid van het vervoer, dat wil zeggen, anterograde v. retrograde te bevestigen. Onze benadering van beeldvorming GFP uiten van neuronen is gebaseerd op een standaard wide-field fluorescentiemicroscoop uitgerust met een CCD-camera, beeld software voor het vastleggen, en een verwarmd imaging kamer. We hebben belicht een breed scala van organellen of structuren, bijvoorbeeld, dichte-core vesicles, mitochondria, de groei kegels, en actine zonder speciale lenzen of excitatie andere eisen dan een TL-lichtbron. Bovendien kunnen spectraal-onderscheiden, fluorescent gelabelde eiwitten, bijvoorbeeld GFP en DsRed-gemerkte eiwitten, gevisualiseerd in de buurt gelijktijdig mee te vervoeren of andere gecoördineerde cellulaire gebeurtenissen karakteriseren. De imaging benadering hier beschreven is flexibel voor een verscheidenheid aan grafische toepassingen en kan worden vastgesteld door een laboratorium voor relatief weinig kosten mits een microscoop beschikbaar is.

Protocol

Deel 1: Transfectie van neuronen met behulp van Lipofectamine 2000 (Invitrogen)

Apparatuur set-up:

Rat of muis hippocampale neuronen worden gekweekt volgens de Kaech en Banker, 2006 [4]. De typische celdichtheid gebruikt voor transfecties is 250.000 cells/6-cm gerecht. Benodigde reagentia en apparatuur zijn 50 mM kynurenic zuur, regelmatig benchtop buis houder, een benchtop koeler (best om Lipofectamine reagens koud te houden),
Lipofectamine reagens, MEM, microfugebuizen buizen, micropipetters, en steriele pincet.

Procedure:

1. Voor elke transfectie label twee 1,5 ml buisjes, een op het plasmide DNA, een aan de transfectiereagens bevatten bevatten. De volgende incubaties kan gaan bij kamertemperatuur.
   1. Combineer 1,0 ug van plasmide DNA met 100 ul MEM in een buis (zonder supplementen van elk type, MEM hoeft niet de temperatuur van de pH in evenwicht zijn).
   2. Combineer 6,0 pi Lipofectamine met 100 pi MEM in de andere 1,5 mL buis.
      1. Geen aanpassingen voor dubbele transfecties nodig zijn, hoewel de Lipofectamine: DNA-ratio zal worden gehalveerd in dergelijke gevallen. De verhouding van Lipofectamine: DNA is nog binnen de suggestie van de fabrikant. Het beste is om 0.5-1.0 microgram test voor elke plasmide voor een optimale expressie.
      2. Voor het behoud van de houdbaarheid van de Lipofectamine reagens, moet worden verwijderd uit de koelkast zo kort mogelijke tijd en geplaatst in een benchtop koeler wanneer niet in gebruik.
         Totale tijd uit de koelkast moet worden tot een minimum beperkt.
2. Incubeer de buizen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
3. Breng de DNA-in-MEM-oplossing in de lipide buis, en meng met een pipet, dan incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
4. Na 25 minuten, voordat flipping dekglaasjes, voeg 60 ul van 50 mM kynurenic zuur om excitoxic schade aan de schotel van gekweekte neuronen te minimaliseren.
   1. Zorgvuldig flip coverslips voeten-side-up met steriele pincet, en regelen zodat ze elkaar niet overlappen. Wees voorzichtig dat u de neuron gecoate oppervlak van het dekglaasje of de glia-gecoate oppervlak van de schaal te schrapen.
5. Duurt ongeveer 0,5 ml van medium uit de 6-cm schotel en voorzichtig met DNA mix in tube, weer over de DNA-oplossing om de schotel te druppelen gelijkmatig op het oppervlak van het medium.
6. Geen krul, maar schuif schotel heen en weer in een richting, dan stoppen en herhalen in loodrechte richting gelijkmatig te verdelen van de DNA-Lipofectamine complexen. Incubeer gedurende 90 minuten in de weefselkweek incubator (37 ° C, 5% CO _2).
7. Flip coverslips voeten-side-down, en leg zodat ze elkaar niet overlappen. Laat uitdrukking om door te gaan voor de gewenste tijd, meestal 's nachts tot 48 uur.

Deel 2: Leef beeldvorming van GFP-gelabelde dense-core blaasjes in gekweekte hippocampale neuronen

Apparatuur set-up:

1. Beeldvorming van levende cellen is een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een CCD-camera, we gebruiken een Leica DMI 6000B omgekeerde microscoop uitgerust met de Leica variabele, TL-lamp. Ook verplicht is een imaging kamer met temperatuur-controller en een objectieve verwarming. We maken gebruik van de Warner Instruments RC-21BR aangepast voor een 18-mm dekglaasje naast een platform verwarming (cat. # PH2) en temperatuur controller (cat. # TC324B). De kamer bevat geen open poorten, een wijziging die kunnen worden opgenomen bij het bestellen van de kamer. Een objectieve verwarming wordt ten zeerste aanbevolen om de temperatuur van het dekglaasje te behouden en het minimaliseren van veranderingen in focus als gevolg van temperatuurschommelingen. Beelden worden verworven met een Hamamatsu Orca-ER met behulp van Metamorph (Molecular Devices) software met inbegrip van de 'streaming' mode van de overname drop-in. Opmerking-We maken geen gebruik van een klimaatkamer die de hele microscoop omsluit. Deze toevoeging is duur en niet noodzakelijk voor de korte termijn imaging hier beschreven.
2. Andere apparatuur en reagentia omvatten vers bereide live-imaging medium (1X Hanks met Ca ^{2 +} en Mg ^{2 +,} 0,6% glucose en 10 mM HEPES), extra 18-mm glas dekglaasjes, steriel pincet, niet-steriel pincet, Kimwipes, vacuüm vet , en een spuit (zonder naald, of met aangepaste wide-naald) waarmee vet van toepassing zijn.

Procedure:

1. Bereid deze live-imaging medium (1X Hanks met Ca ^{2 +} en Mg ^{2 +,} 0,6% glucose en 10 mM HEPES). We meestal voor te bereiden 50mls op een tijdstip en bewaar bij 4 ^° C wanneer niet in gebruik. Het is het beste om voldoende voor te bereiden op niet meer dan een week op een moment. Ongeveer 5-10 ml worden gebruikt per gerecht van neuronen.
2. Start microscoop, camera, tl-lamp, en beeldacquisitie software. Ook zet de stroom naar de kamer platform en objectieve kachels.
3. De voorbereiding van de voorstelleng kamer.
   1. De Warner kamer is voorzien van een Teflon te voegen voor de montage van dekglaasjes. Voor het gemak van manipulatie, het etiket de ene kant van de insert "top" met een permanent marker.
   2. Breng een ring van vet aan op de groef rond het gat in de zijkant van de kamer met het label "top". Vermijd het gebruik van teveel omdat het de kamer in te voeren en verminderen de waarneembare omgeving.
   3. Met behulp van een tang, voeg een schone, ongebruikte 18-cm dekglaasje naar de "top" kant van de kamer, druk zachtjes op de dekglaasje op de randen om een ​​goede afdichting in de uitgespaarde gleuf van de kamer te creëren.
   4. Draai de kamer op en breng een soortgelijke ring van vet aan op de groef aan de andere (onder) kant van de kamer.
   5. Plaats de voorbereide kamer-bottom up-side op het deksel van een 50-mL buis, dat is een ideale kamer houder.
   6. Voeg 750 ul van imaging medium naar de kamer. Dit is een te grote hoeveelheid, maar het vet moet het medium te voorkomen dat morsen over en het overschot zal helpen voorkomen dat bellen van vast komen te zitten wanneer de cel bedekte dekglaasje wordt toegepast.
   7. Handhaaf de voorbereide kamer in de weefselkweek incubator totdat het nodig is. Langdurig incubaties, moet ~ 1 uur worden vermeden omdat de beeldvorming medium zal verdampen en verandering in samenstelling.
4. Voer de laatste kamer assemblage en live cell imaging.
   1. Verplaats de voorbereide kamer en een schotel van getransfecteerd dekglaasjes van de incubator van de weefselkweek kap.
   2. De laatste kamer assemblage moeten snel worden uitgevoerd om ervoor te zorgen de cellen blijven ondergedompeld in middelgrote en bij 37 ° C continu.
   3. Met behulp van steriele pincet voorzichtig een dekglaasje te verwijderen uit de getransfecteerde schotel, tegen de rand van het dekglaasje een Kimwipe om weg te trekken groeimedium.
   4. Plaats het dekglaasje neuron-side-down op de voorbereide kamer. Raak de ene kant van het dekglaasje om het vet eerste en brengen druk aan rond de randen om het dekglaasje flat te brengen zonder luchtbellen trapping. Overtollig imaging medium zal morsen zoals verwacht.
   5. Veeg overtollige beeldvorming medium, maar wees voorzichtig dat u de dekglaasjes slide uit positie.
   6. Verplaats de kamer om de voorverwarmde platform verwarming en zet de kamer op zijn plaats.
   7. Breng de kamer op het podium.
   8. Te verminderen photobleaching en photoxicity, stelt u de lamp aan het minimumbedrag van de intensiteit nodig is om getransfecteerde cellen te vinden.
   9. Zoek een cel van belang met een lage vergroting olie doelstelling (40X). Het is goed vast te houden aan een geplande zoekpatroon tot maximale dekglaasje dekking te verzekeren en om overbodige imago overnames, bijvoorbeeld, links bovenaan dekglaasje, het scannen op en neer te werken aan de rechterkant te vermijden.
   10. Schakel over naar een hoge vergrotingsfactor olie objectief (60-100x) eenmaal een gewenste veld is gevestigd.
   11. Gebruik "stroom overname" of vergelijkbare functie van uw imaging software om een ​​video van fluorescent gelabelde eiwitten dynamiek vast te leggen.
   12. Neem een ​​fase image en eventuele andere begeleidende beelden (bijv. oplosbaar GFP) voor latere analyse en presentatie.
   13. Bewaar alle beelden voor het verkennen van de dekglaasje verder en het opnemen van de volgende video.
   14. Typisch 3-5 video's uit een dekglaasje wordt als succesvol beschouwd. Fototoxiciteit en de algemene gezondheid van de cellen moet in gedachten worden gehouden als het vervoer wordt verminderd in beschadigde cellen. Gezondheid van de cellen kan worden gecontroleerd door observatie met behulp van fase microscopie. Typisch opnames worden uitgevoerd voor ongeveer 30 minuten per dekglaasje aan.

Deel 3: representatieve resultaten:

Live-cell imaging waarnemingen meestal bestaan ​​uit video's (ook bekend als "stacks" van de beelden) dat het verkeer van fluorescent-gelabelde organellen geven binnen het gezichtsveld (figuur 1A). Begeleidende elke video zijn vaak ondersteunende beelden die richting van het gezichtsveld te illustreren met betrekking tot het cellichaam, het niveau van eiwitexpressie en / of de gezondheid van de cel. Video's van transport kan worden onderworpen aan kwantitatieve analyse door transformatie naar kymographs (Figuur 1B). Kymographs zijn beelden die deeltjes beweging illustreren aan de lijn naast elkaar scans waar elk tijdstip wordt voorgesteld door een kolom in de kymograaf. Figuur 2 laat zien hoe twee deeltjes bewegen in tegengestelde richting zijn vertegenwoordigd in een kymograaf. Verdere analyse van kymographs kan informatie verstrekken over de deeltjes flux, snelheid, oplage, omkeringen, en stilstaande deeltjes.

Figuur 1. Vertegenwoordiger live cell imaging Opmerkingen. (A) Geselecteerde beelden uit een video van mCherry-tagged weefsel plasminogeen activator (TPA) transport. Individuele deeltjes bewegen in de anterograde (groene pijlen) en de retrograde (rode pijlen) richtingen worden aangegeven. (B) Kymographs illustreren TPA-mCherry beweging in deaxon. Horizontale lijnen in kymographs vertegenwoordigen stilstaande objecten, terwijl diagonale lijnen staan ​​voor organellen af ​​te stappen van (positieve helling) of in de richting van (negatieve helling) van de cel lichaam. De lange groene en rode pijlen geven de pistes die overeenkomt met de deeltjes in (A). Veranderingen in het vervoer als gevolg van de microtubuli depolymerizing reagens, nocodazole, is ook geïllustreerd met een kymograaf. Let op de vermindering van de bewegende organellen door het ontbreken van diagonale lijnen.

Discussion

Live-cell imaging is een uitdagende, maar krachtige techniek voor de directe waarneming van organel transport in gekweekte neuronen. Problemen kunnen ontstaan ​​stroomopwaarts van de procedure met een slechte gezondheid neuron te wijten aan de cultuur complicaties. Daarom moeten cel gezondheid (voor voorbeelden zie ref. 4) worden beoordeeld voor en na transfectie door het observeren van de dekglaasjes terwijl in groeimedium met behulp van een weefselkweek lichtmicroscoop. Het proces van de overdracht van neuron-bevattende dekglaasjes om de beeldvorming kamer kan stressvol zijn voor de cellen, dus is het belangrijk te betrachten bij het manipuleren van de dekglaasjes. Het kan worden gemeenschappelijk voor gezond uitziende cellen geen vervoer als gevolg van vertragingen in de procedure, of onvolledige voorverwarming van apparatuur of het evenwicht van de imaging media te tonen. Voor het transport analyse van de axonale en dendritische oriëntatie moet bekend zijn, namelijk: anterograde en retrograde transport. Het is daarom van groot belang om er zeker van dat de locatie van een cel lichaam is bepaald en dat een continue neuronale segment kan worden gezien de aansluiting van de regio van belang zijn voor de cel lichaam. Vaak opslaan overlappende beelden van oplosbare GFP, of informatief benoemen van de opgeslagen videobestand, is voldoende om de processen 'oriëntatie voor analyses, bijv. "Cell1CellBodyUpperLeft" vast te stellen.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
MEM-Eagle with Earle salts and L-glutamine	Reagent	Mediatech, Inc.	10-010-CV
Lipofectamine 2000	Reagent	Invitrogen	11668-027	Transfection reagent
10X Hanks with Ca2+ and Mg2+	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	14185-052	Live-imaging medium
1M HEPES	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15630-130	Live-imaging medium