线虫神经肌肉交界处的解剖和录制

Summary

电的应用访问突触的突触活动提供量化的测量，分析突触的突变体。本文介绍了一种夹层的方法，用来揭露神经肌肉接头（NMJ）

Abstract

神经递质是其中神经元突触后的目标，快速的时间尺度上，通过化学信号传输的信息的过程。这一复杂的过程，需要许多前和突触后蛋白的协调活动，以确保合适的突触连接，电信号的传导，目标和分泌泡，钙传感，囊泡融合，本地化和突触后受体的功能的吸，最后，​​回收机制。作为神经学家，它是我们的目标是澄清在其中的每个步骤功能的蛋白质，并了解他们的行动机制。从突触的电生理记录提供一个量化的基础突触传递过程中发生的电气事件读出。通过结合这项技术可用于处理C.突触蛋白的分子和遗传工具，强大的阵列线虫 ，我们可以分析导致突触传递功能的变化。

c. 在线虫 NMJs之间形成运动神经元和体壁的肌肉控制运动，因此，不协调locomotory表型（UNC小号）的突变体，往往^扰乱这些突触1突触传递。由于UNC突变体的一种细菌的食物来源丰富的供应维持，他们依然是可行的，只要保留一些咽抽水能力摄取食物。这一点，连同事实，C 。 线虫为雌雄同体的存在，使他们能够通过突变后代，而不需要精心设计的交配行为。这些属性，再加上我们最近从蠕虫记录NMJs ^2,3,7这是一个很好的模式生物来解决如何准确 UNC突变影响神经递质的能力。

解剖的方法包括使用cyanoacrylic胶，以使切口暴露在蠕虫的NMJs角质层固定成虫。由于C。线虫成年人只有1毫米的长度进行解剖与解剖显微镜的使用，需要良好的手眼协调。 NMJ录音是由全细胞电压钳位个人体壁肌肉细胞和神经递质的释放，可以使用各种刺激的协议，包括电疗，光激活通道的视紫红质介导^的去极化4和高渗盐水，所有这些都将是诱发简要描述。

Protocol

A.准备清扫工具。

1. 解剖/录音室：我们通常构造我们的录音室，一个1 ^/ 16英寸磁板到大到足以容纳一个直径为22毫米的圆形玻璃盖的中心，这是钻了圆孔，。香港总商会的外部尺寸将取决于用来做录音显微镜阶段。在磁板的背面，我们重视一个48 × 60毫米盖玻片，我们坚持低熔体Paraplax组织包埋蜡颗粒放置在盖的每个角落室滑夹在玻璃和商会之间的。蜡，然后融化在热板，玻璃板朝上，直到它形成一个连续的层粘合盖玻片室。不要离开这一步无人值守的蜡融化迅速。被删除，冷却室应尽快蜡融化。使用刀片边缘，可以去除多余的蜡，其上有22毫米的圆形孔洞的内缘渗透。
2. Sylgard涂层的盖玻片：22毫米，是放置在录音室的圆形空腔的Sylgard涂层盖玻片上进行剥离。 Sylgard大衣有助于坚持cyanoacrylic胶盖滑时胶合蠕虫，也作为一个气垫上打破胶枪头当它成为插入的行为。 Sylgard是由新鲜根据制造商的说明（10份有机硅基地，1份固化剂按重量计）。一个Sylgard小降，然后放置在每个盖玻片和整个使用刀片边缘，使表面均匀抹上。涂盖玻片放置在大型平板盖的容器中，并在65 °度的烤箱一夜之间治愈。
3. 移液器：通常情况下，我们使用相同的1毫米外直径长丝硼硅玻璃产生胶合蠕虫下降移液器，使肌肉从角质层的切口和录音，使用一个电极的车夫。明智的做法是拉，然后再尝试一个夹层，这个阶段可能需要几个快速交流的移液器一罐的移液器。
4. 胶机：胶是胶水吸管尖口压力，加载和应用。胶合吸管插入一块相匹配的吸管玻璃（通常为1毫米）外径与内径的聚乙烯管材的2脚的一端。油管的另一端持有的Eppendorf枪头，作为一个口片。
5. 提取移液器：必须从蠕虫腔移除蠕虫内脏，一旦角质层切口已取得。这是实现与油管连接到一个小指枪头类似胶机，但在这种情况下玻璃提取枪头被打破，足以让蛋和内脏，容易吸尘蠕虫腔。

B.剥离

1. 在录音室中绘制一个圆形的蜡笔线接近的一个Sylgard涂层的盖玻片压在坚决室（Sylgard涂层朝上）的周长。这蜡线无法移动盖玻片，防止渗下撞出解剖和录制时的盖玻片的录音解决方案。会议厅内充满了录音解决方案外，一些蠕虫在使用蠕虫挑中心放置。蠕虫会在溶液中游泳，但是与实践，这些蠕虫可以粘下来没有任何进一步的程序，如冷却，以防止运动。在训练阶段，它可以帮助实践胶合突变，其中游泳是受损的蠕虫（如UNC - 31突变体）。
2. 古板，蜡或黏土举行的PCR第一个胶容器是用来举行cyanoacrylic胶股票。胶类似的提示尺寸录音移液器吸液管（通常〜4兆欧电阻）用于申请胶水。使用胶机，少量的胶水的胶吸管吸，用解剖的范围，以形象化的枪头胶水是吸了。
3. cyanoacrylic胶（HistoacrylBlue，Aesulap）聚合接触外录音解决方案，因此重要的是要保持正压上胶吸管，因为它进入会议厅的解决方案，以防止胶水硬化和堵塞吸管。只要在会议厅内的解决方案是胶吸管，小，但络绎不绝的胶水需要应用到Sylgard表面下口压力控制，以防止堵塞。如果插入吸管变成它有时可以轻轻拍打sylgard镀膜玻璃的一角畅通。建议你练习，然后再尝试粘合胶蠕虫。 Sylgard上的胶，如果你能经常写你的名字与线比蠕虫宽度薄的信件，你准备PROCEED到蠕虫角质层粘合。
4. 粘上一种蠕虫病毒，使用正压蠕虫的头部或尾部附着少量的胶水，并迅速Sylgard表面上绘制蠕虫。试图附加商会中心附近的蠕虫病毒，蠕虫粘太靠近边缘，将很难达到录音移液器。然后，应用胶沿背侧缘蠕虫的角质层开始附件络绎不绝，迫使与所面临的外来外阴（腹侧肌肉录音）的C位置的蠕虫病毒。在这种胶线的任何空隙，所以应填写该蠕虫强烈重视，在角质层切口步骤分离，以防止蠕虫。
5. 为了使角质层切口，切换到手持式清扫吸管。这种吸管需要比胶水/录音移液器更清晰，有一个短的，坚固的轴。解剖范围内使用的最高放大倍率，对准吸管蠕虫的纵轴平行，约沿切口在角质层/胶水界面（外阴）蠕虫的中点插入的提示。这个切口，释放蠕虫的静水压力，迫使通过切口点鸡蛋和肠。继续对蠕虫的头切割切片类似的议案，打开信的角质层，直到您到达咽。切换到提取吸管真空机关内部的蠕虫。打开角质层清除切口后，将保留它的圆柱形状。使用新鲜的粘合吸管点焊到Sylgard表面的角质层切边。重要的是，在这个阶段中使用最少的胶点，以避免损坏或模糊的NMJs。
   腹侧神经线和体壁肌肉，现在暴露出来。
6. 要删除基底膜覆盖的NMJs，从腔吸外的录音解决方案，并申请胶原酶（外录音解决方案0.4mg/ml）约10-20秒;删除，并用新鲜外录音解决方案几次。进入录制阶段。

C.膜片钳记录

1. 位置上升显微镜10倍的目标，中心蠕虫阶段的录音室。切换到一个40倍的水，再现与DIC的目标和检查，体壁的肌肉和神经线都完好无损。蠕虫的位置，使蠕虫的纵轴是与前边缘的范围平行，使电极的左，右两侧推出。
2. 使用标准的膜片钳技术来修补肌肉。约4兆欧电阻的记录电极工作。一旦电极接触的肌肉膜，增加负压，直到获得一个千兆欧密封。对于全细胞电压钳记录模式，适用于更多的吸力和ZAP膜破裂，直到千兆欧密封。在一个良好的记录，通常有野生型成虫体壁肌肉细胞膜的〜70 pF的电容和可稳定在-60以最小的控股电流（〜50 mV的控股潜力至少10分钟的记录PA）。
3. 外的录音解决方案，包括（毫米_）：2 5 150氯化钠，氯化钾，氯化钙_，氯化镁 2 4 5，蔗糖，葡萄糖10，HEPES 15（pH值7.3〜330mOsm ）。包含的修补程序吸管（毫米），氢氧化钾20 120氯化钾，氯化镁₂ 4 5（的N -三羟甲基] mthyl - 2 - aminoethane磺酸）工商业污水附加费，二水_氯化钙 0.25，NA ₂ ATP 4，蔗糖36 5，EGTA（pH值7.2〜312 mOsm）。注：这些解决方案人为负载氯化肌肉细胞，使GABA受体介导的电流向内由于氯在保持电位-60 mV的外排。这些解决方案的变化，已使用（详情请参阅出版物）。
4. 诱发释放。通常我们把第二个电极包含腹侧神经脊髓前修补肌肉细胞外液。这种松散的补丁配置需要大量的去极化刺激持续时间短（10S伏）（1毫秒），以达到最大的诱发反应（通常为2.0-2.5 NA）在野生型蠕虫。这种方法的局限性是：1）只有少数诱发反应可交付前的神经线造成不可挽回的损坏，原因不明2），只胆碱诱发的反应可以引起使用这种刺激的配置。
5. 光激活通道的视紫红质的刺激。最近，戈特沙尔克实验室已经产生了转基因蠕虫表达藻类衍生的通道视紫质，光刺激后的膜去极化神经元亚群，用于^驱动表达4的启动子上。在的C.线虫 NMJ，表达的胆碱能运动神经元或GABA能运动神经元通道的视紫红质的综合线现在availablE.由于通道的视紫红质只响应光时，全反式视黄醛与视蛋白基团，用于此应用程序的蠕虫，必须对视网膜股价的细菌生长。一个绿色的光脉冲，然后可以用来反复激活通道的视紫红质，造成诱发ACH或GABA的释放，这取决于使用转基因蠕虫。这些转基因的蠕虫可以越过边界进入突变株。这比以前的电刺激技术的优点包括：1）光激活不引起神经元的损伤，使许多重复的刺激要执行和2）诱发释放要么GABA能和胆碱能运动神经元可独立研究。
6. 高渗诱导释放。要测量的很容易，可释放囊泡池（反映的催芽囊泡总结所有到的记录肌肉NMJ的池），一个压力，吸管含高渗外解决方案，通过添加额外的蔗糖〜850 mOsm使用的大小。 1-3秒的压力脉冲应用，产生突触后使用上述标准的解决方案的异步事件接二连三。

图1：原理概述了C.线虫解剖和神经肌肉记录配置

一个sylgard涂涂抹隔着玻璃和固化Sylgard下降盖玻片一夜之间被放置在圆形空腔预制录音室与录音解决方案涵盖。在中心放置了一个蠕虫病毒是从头部或尾部，蠕虫的背侧施加胶，用胶吸管，粘Sylgard表面。刷胶是完成后，毗邻外阴切口，在接口之间的角质层和胶水是用玻璃针和扩展向头部（见红穿孔线）。提取内脏和体腔的鸡蛋，切口切缘是现场焊接用胶水Syl​​gard露出腹侧神经（绿色）和体壁肌肉（红色）。外阴前腹内侧肌肉补丁钳位和刺激电极放置在上游的神经线。

代表性的成果

全细胞电压钳位体壁肌肉录音显示每个刺激（电诱发，光诱发高渗反应）上文所述的三个协议。在所有情况下的腹内侧的体壁肌肉被钳制在-60 mV的。 A.野生型的肌细胞通常表现出内源性抵港的缩影，在我们的标准录音解决方案的突触电流的高利率。 B.一个2ms的去极化的前腹神经索的原因造成约2-2.5 nA的一个大诱发的反应，在野生型蠕虫的几个突触同步发行。野生型的痕迹权的代表在A和B的痕迹，显示在严重不协调的突变（UNC - 18）的突触释放。 C组显示了从野生型蠕虫，胆碱能神经元的表达通道的视紫红质的神经肌肉交界处的光诱发反应。 2ms的光脉冲，通常会产生1.5-1.8 nA的响应。 D.压力弹射到1秒的肌肉高渗盐水850 mOsm，生产的微型突触电流囊泡容易松解池的异步攻势。

Discussion

遗传模式生物，线虫是非常适合的突触传递的研究，通过突触蛋白编码基因的突变在功能分析。在这里，我们描述了一个夹层技术，呈现了C.线虫 NMJs电生理分析访问。影随行描绘了C.的关键步骤线虫的解剖和典型的录音配置，用于测量突触活动。在学习这一技术带来的最大挑战的三个步骤; 1）蠕虫胶合一步，2）执行一个成功的切口，3）体壁肌肉的修补。一旦这些已经掌握，准备适合的电压钳或电流钳模式记录突触后肌。诱发刺激的反应可以很容易地使用各种突变的背景解剖准备。由于野生型成虫（1毫米长）已经分钟的大小，突触的突变体没有达到成年或保持骨瘦如柴，可能不适合这种清扫方法。也非常小的腹神经索的运动神经元（细胞SOMA的2-5微米）构成额外electrophysiologists的挑战，虽然有几个实验室已成功地从 C记录这里描述的线虫神经元变化的解剖准备^5月6日 。