Summary
يمكن أن القدرة على قياس حركية الافراج حويصلة تساعد على توفير نظرة ثاقبة بعض أساسيات العصبي. المستخدمة هنا فإننا في الوقت الحقيقي التصوير من الحويصلات المسمى مع وزير الخارجية صبغ أحمر فلوري 4-64 لقياس معدل الافراج قبل المشبكي حويصلة في الثقافات العصبية الحصين.
Abstract
يمكن أن القدرة على قياس حركية الافراج حويصلة تساعد على توفير نظرة ثاقبة بعض أساسيات العصبي. المستخدمة هنا فإننا في الوقت الحقيقي التصوير من الحويصلات المسمى مع صبغة FM لرصد معدل الافراج قبل المشبكي حويصلة. FM4 - 64 هو صبغ أحمر فلوري amphiphilic styryl أن يضمن في أغشية الحويصلات متشابك كما هو حفز الإلتقام. التفاعلات محبة للدهون يؤدي إلى زيادة صبغ كثيرا في مضان مما يؤدي إلى انبعاث إشارة ساطعة عندما يرتبط مع حويصلات واحد عندما الاسمية في السائل خارج الخلية. يستخدم بعد خطوة للمساعدة على إزالة غسل الصبغة الخارجية داخل غشاء البلازما ، ويتركز وزير الخارجية المتبقية داخل الحويصلات وطرد بعد ذلك عندما يتم بفعل إيماس جولة أخرى من التحفيز الكهربائي. يقاس معدل الإفراج الحويصلات الناتجة عن انخفاض في مضان. منذ يمكن تطبيقها FM الصبغة الخارجية وعابر ، بل هو أداة مفيدة لتحديد معدلات إيماس الثقافات في الخلايا العصبية ، وخصوصا عندما تقارن بين معدلات ونقاط الاشتباك العصبي transfected حبات السيطرة المجاورة.
Protocol
الخلايا : الجرذ (أو الماوس) الابتدائي الثقافات العصبية قرن آمون (14-28 يوما في المختبر).
تنبيه : الكهربائية ، وتسليمها عبر أقطاب البلاتين اثنين ؛ 70-90 بالسيارات
المجهري : 60x عدسة المجهر النفط على اتفاقية مكافحة التصحر مقلوب الفلورسنت.
البرنامج : Slidebook (التصوير الذكي الابتكارات ، وسانتا مونيكا ، كاليفورنيا)
انظر الصفحة أساليب تكميلية لمزيد من التفاصيل
- الحارة HEPES - مخزنة المالحة (HBS) إلى درجة حرارة الغرفة. إضافة الغلوتامات مضادات مستقبلات APV (50 ميكرومتر تركيز النهائي) وCNQX (10 ميكرومتر النهائي). كل تجربة FM يتطلب عادة 20-30 مل HBS. تركيز للعمل من 10 ميكرومتر FM 4-64 (المسابر الجزيئية) ، تمييع الحل في الأسهم 1:1000 HBS (مع الخصوم المضافة). 2 مل جعل FM soln لكل تجربة. الحل مع تغطية احباط لمنع التعرض للضوء.
- تحميل ساترة تحتوي على الخلايا العصبية على الغرفة الكهربائي. تأكد من أن وسائل الإعلام في الغرفة مع مستوى أعلى من غرفة ويغطي تماما الأقطاب. إزالة أي حل الزائدة من أسفل ساترة. إضافة إلى النفط العدسة (اذا كنت تستخدم عدسة النفط).
- إعداد جهاز نضح. شطف الأولى مع قليل من كل مل بعد بالترتيب معينة (يسمح لكل موضوعي ودقيق قبل إضافة المقبل) : الماء ، والإيثانول ، والمياه ، ثم HBS. إضافة المقبل HBS (حفظ مل قليلة لإضافة باليد في الخطوات المستقبلية) وإغلاق الارواء. إعداد منفذ نضح والشفط على طرفي نقيض في حواف ساترة. فمن الأفضل إذا كان منفذ نضح تصل الى غرفة ، حيث كما يجب أن يبني الشفط في أعلى جدا. في حين اضاف HBS (إما عن طريق رذاذ أو باليد) ، افتح الشفط وتعديل موقفها بحيث يحافظ على وسائل الإعلام على مستوى الحق فقط تغطي تماما الأقطاب.
- ابحث عن منطقة تقع على ساترة كنت ترغب في صورة ومحاولة جمع ما يقرب من ذلك في التركيز. المناطق المثلى تحتوي المشابك كثيرة ، ولكن لا ينبغي أن يكون كثيفا جدا بحيث تصبح العمليات الفردية تمييزه. وينبغي أن يكون هناك أي إلى الحد الأدنى من أجسام الخلايا والأغشية غريبة (مثل كتل من الخلايا النجمية) ، أو مواد غير محددة أخرى (مثل الوبر). قد صبغ FM التقيد بهذه nonspecifically.
- استخدام "مجموعة العمل" المكعب تصفية (الذي يثير مع ضوء أخضر وأحمر يجمع إلى أبعد من انبعاثات الحمراء). تعيين "تفضيلات التقاط" Slideview لتسليم 900 AP في 10Hz عند ظهور صورة (تستخدم عادة 300-900 نقاط وصول لهذا التحفيز التحميل) 0. في إطار الصورة ، وحدد "fluo - VIS الحمراء" ضبط الوقت وتغيير فلتر التعرض إلى 100 مللي ثانية. إيقاف أية إعدادات timelapse موجودة من قبل. لا تأخذ أي صور حتى تكون على استعداد لبدء التحفيز.
- تأكد من الشفط على / فتح. إضافة بسرعة soln FM (2 مل) إلى غرفة في الطرف المقابل من الشفط. اضغط على الفور ما يرام في إطار الصورة لالتقاط صورة ويبدأ التشويق. انتظر 30-45 ثانية بعد التحفيز ثم يغسل بسرعة FM بإضافة ~ 2 مل من HBS (أفعل ذلك من خلال جنب مع ماصة ، ولكن يمكن أيضا أن يتم ذلك بواسطة التروية).
- غسل FM مع HBS عبر نضح لمدة 10 دقائق ~. وينبغي أن يكون معدل تدفق 1-1،5 مل / دقيقة. أثناء هذه الخطوة غسل تغيير تفضيلات التحفيز بحيث يبدأ ظهور التحفيز @ صورة 10 (تستخدم عادة 900-1200 نقاط وصول @ 10 هرتز لهذا التحفيز destaining). حوالي 7 دقائق في الغسيل ، وتحقق مضاعفة التفضيلات (بداية من الحوافز في صورة 10). تستخدم الآن في إطار التركيز الصغيرة اختيار وتركيز دون الإقليمية. تأكد بأنه قد تم تغيير إعدادات التنبيه قبل الشروع في الخطوة التالية. التقاط صورة واحدة لمعرفة ما اذا كانت تغسل كاملة (وينبغي أن نقاط الاشتباك العصبي punctated الفردية بشكل واضح). إن لم يكن ، وزيادة معدل تدفق an 0.5mL/min إضافية ، وانتظر دقيقة أخرى 2.
- يغسل مرة واحدة كاملة ، وضبط الوقت والتعرض اللازمة لاستقبال ما زالت جيدة ، إشارة واضحة (وعادة ما بين 5-10 مرات. التعرض مللي ينبغي التقليل بسبب photobleaching السريع للFM). ثم تعيين تفضيلات timelapse على اتخاذ الصور 38 كل 5 ثوان. التحقق من نضح لجعل هناك ما يكفي من HBS لمدة 5 دقائق ، ومغادرة نضح المتدفقة. بدء timelapse لبدء destaining.
- بعد يزيل اللون ، أو تغيير إعدادات التحفيز لتقديم AP 1200 @ 10Hz (1200-2000 عادة تستخدم نقاط وصول لهذه الخطوة النهائية) على صورة 0. إيقاف الإعدادات timelapse واتخاذ صورة واحدة لبدء التحفيز. يجب أن تكون لا تزال تتدفق نضح هذه الخطوة سوف تساعد على إزالة أي صبغة المتبقية FM الحويصلي ، من أجل تحديد خط الأساس / "مجموع نشره" مضان. بعد الانتهاء من التحفيز ، إيقاف الإعدادات التحفيز ، وجعل المنطقة في التركيز. إغلاق نضح والشفطوبعد ذلك يأخذ صورتين الأساس النهائي. يمكن اتخاذها سواء لوحات واحد أو Z - كومة صور (0.5 ميكرومتر الخطوات). Z - المداخن هي مفيدة في حال كان هناك تحول في الطائرة من التركيز أثناء التجربة.
- يتم تجربتك FM. إذا كان القيام على الفور المزيد من التجارب ، يجب تنظيف العدسة وبين كل غرفة المحاكمة ، ولكن جهاز نضح لا يلزم أن يكون تنظيفها حتى بعد التجربة النهائية. شطف الجهاز بالكامل مع الماء ، ثم الايثانول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وإمكانات العمل 300 (APS) كافية لإحداث ما لا يقل عن جولة واحدة من إعادة تدوير الحويصلة ، حافزا التحميل من 300 نقاط وصول ، أو تعطى غالبا ما تكون أكثر لتسمية تجمع تدوير الحويصلات. على الرغم من المحفزات تحميل أكثر كثافة ، مثل 900 كالة الأنباء الجزائرية ، قد تسمح لعدد رمزي من الحويصلات إضافية ليكون المسمى ، وهذا يزيد أيضا من مقدار الوقت الصبغة يمكن تضمينها في الأغشية خارج الخلية ، مما يؤدي إلى مزيد من تلطيخ غير محددة. لقد وجدت هذه الخطوة ستكون حاسمة لغسل لضمان destaining المناسبة. من المهم أن يروي مع معدل التدفق 1-1،5 مل في الدقيقة الواحدة ، وعادة لمدة 10 + 2 دقيقة. ويمكن اتخاذ صورة واحدة ~ 7 دقائق من بداية غسل لرصد مدى إزالة الصبغة. إذا لزم الأمر ، يمكن أن يكون معدل التدفق أو الوقت ويغسل زيادة طفيفة. لتجاربنا كان غير مرغوب فيه ليغسل والمضي قدما أكبر من 10-12 دقيقة لأن هذا يزيد من احتمال فقدان حويصلة وضع العلامات من خلال الأحداث إيماس العفوية التي قد تحدث حتى عندما تكون الخلية في حالة راحة. للخطوة destaining ، كانت تدار 900-1200 نقاط وصول إلى الإفراج عن جميع الحويصلات المسمى. بالإضافة إلى ذلك قدمت في كثير من الأحيان نقاط وصول أخرى 1200-2000 إلى الحصول على قيمة أساسية من "مضان نشره" ، وتستخدم لتطبيع البيانات destaining.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APV | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| FM 4-64 | Molecular Probes, Life Technologies | T-3166 | |
| CNQX disodium salt | Sigma-Aldrich | C-239 |
References
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
