A capacidade de medir a cinética de liberação de vesícula pode ajudar a fornecer a introspecção em alguns dos princípios básicos da neurotransmissão. Aqui usamos imagens em tempo real das vesículas marcadas com o corante fluorescente vermelho FM 4-64 para medir a taxa de liberação de vesículas pré-sinápticas no hipocampo culturas neuronal.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Medição Exocitose em Neurônios Usando Labeling FM
Neste artigo
Resumo
Resumo
A capacidade de medir a cinética de liberação de vesícula pode ajudar a fornecer a introspecção em alguns dos princípios básicos da neurotransmissão. Aqui usamos imagens em tempo real das vesículas marcadas com corante FM para monitorar a taxa de liberação de vesículas pré-sinápticas. FM4-64 é um corante vermelho anfifílicos fluorescentes styryl que incorpora nas membranas das vesículas sinápticas como endocitose é estimulado. Interações lipofílicas fazer com que a tintura para aumentar grandemente a fluorescência, assim emitindo um sinal luminoso quando associada a vesículas e uma nominal quando no líquido extracelular. Após uma etapa de lavagem é usado para ajudar a remover corante externa dentro da membrana plasmática, a FM restante é concentrado dentro das vesículas e depois é expelido quando exocitose é induzida por outra rodada de estimulação elétrica. A taxa de liberação de vesículas é medido a partir da queda da fluorescência. Desde FM coloração pode ser aplicada externa e transitoriamente, é uma ferramenta útil para determinar as taxas de exocitose em culturas de neurônios, especialmente quando se comparam as taxas entre as sinapses e transfectadas boutons controlo vizinhas.
Protocolo
Células: Rat (ou mouse) principal do hipocampo culturas neuronais (14-28 dias in vitro).
Estimulação: Elétrica, entregues através de dois eletrodos de platina; 70-90 mV
Microscopia: lente 60x de óleo em um microscópio invertido CCD fluorescente.
Software: Slidebook (Intelligent imagem Innovations, Santa Monica, CA)
Consulte a página métodos complementares para mais detalhes
- Quente HEPES-salina tamponada (HBS) à temperatura ambiente. Adicione o receptor de glutamato antagonistas APV (50 mM de concentração final) e CNQX (10 mM final)....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
De 300 potenciais de ação (APs) é suficiente para induzir, pelo menos, uma rodada de reciclagem de vesícula, um estímulo de carga de 300 ou mais APs muitas vezes é dado para rotular a piscina de reciclagem de vesículas. Apesar de estímulos de carga mais intensa, tais como 900 APs, pode permitir que um número nominal de vesículas adicional a ser rotulados, isso também aumenta a quantidade de tempo que o corante pode incorporar nas membranas extracelulares, levando a uma maior coloração não específica. Eu encontrei a etapa de lavagem a ser fu.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada a declarar.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| APV | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| FM 4-64 | Molecular Probes, Life Technologies | T-3166 | |
| Sal disódico do CNQX | Sigma-Aldrich | C-239 |
Referências
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
