Summary
מערכת העצבים stomatogastric (STNS) של הסרטן יונה (
Abstract
הגנגליון stomatogastric (STG) הוא מודל מצוין לחקר אינטראקציות הסלולר ורשת מכיוון שהוא מכיל מספר קטן יחסית של תאים (כ 25 ב C. borealis) אשר מאופיינים היטב. התאים STG בתערוכה מגוון רחב של יציאות ואחראים על פעולות מוטוריות של הקיבה. הבטן מכיל את טחנת קיבה אשר מתפרק מזון עם שלוש שיניים פנימיים, השוער אשר מסננים את האוכל לפני שהוא מגיע midgut. STG מייצר שתי יציאות קצבית לשלוט טחנת קיבה השוער המכונה גנרטורים דפוס מרכזי (CPGs). כל תא STG יכולים להשתתף אחד או שני מקצבים אלה. CPGs אלה מאפשרים לחקר neuromodulation, הומאוסטזיס, השתנות הסלולר רשת, פיתוח רשת, והתאוששות הרשת.
דיסקציה של מערכת העצבים stomatogastric (STNS) מ הסרטן יונה (סרטן borealis) נעשית בשני חלקים: דיסקציה הגולמי בסדר. ב דיסקציה ברוטו הקיבה כולו גזור מן הסרטן. במהלך דיסקציה הקנס STNS מופק הקיבה באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה מיקרו לנתיחה הכלים (ראה תרשים 1). STNS כולל את STG, הגנגליון הוושט (OG), ואת הגרעינים commissural (בורג), כמו גם את העצבים כי innervate את שרירי הבטן. כאן, אנו מראים כיצד לבצע דיסקציה מלאה של STNS לקראת ניסוי electrophysiology שבו התאים STG תהיה רשמה intracellularly ואת העצבים ההיקפיים ישמשו הקלטות תאיים. הטכניקה הנכונה למציאת העצבים הרצוי מוצג, כמו גם הטכניקה שלנו desheathing הגנגליון לחשוף את somata ו neuropil.
Protocol
1. גרוס Dissection
- המקום סרטן על קרח במשך 30 דקות למערכות משעמם החושי והמוטורי של החיה. להקיף אותו מכל צדדיו עם קרח. יש ללבוש כפפות בעת טיפול הסרטן.
- היכונו לנתיחה ברוטו ידי הנחת את המחבת לנתיחה וכלי תשתמש. Rongeurs, עצם חיתוך מספריים, מספריים קטנים, שיניים מלקחיים, מרית עם קצה קוני, צלחת שחורה Sylgard מצופה, וסיכות חרקים יש צורך.
- הסר את סרטן מדלי הקרח ברגל האחוריות כדי למנוע צובט ומניחים אותו במחבת לנתיחה.
- הסר את הטפרים לראשונה על ידי פיתול כל אחד פנימה. ואז להסיר את כל הרגל, תוך שימוש בתנועות פיתול זהה.
- שימוש rongeurs, להסיר את maxilla מכסה את הפה. גם להסיר את maxillule רך.
- שימוש rongeurs שוב, להתחיל מהסוף אחורי רוחבי של שריון ולקבל אחיזה טובה על קצה זה. הצמד מטה עם rongeurs ולשבור את חתיכת שריון משם. הקפד להסיר מספיק שריון כדי לאפשר המרית להיכנס הפתיחה. המשך להסיר את הקצה של שריון עד העיניים לחזור בצד השני.
- עם הצד החד של המרית, לגרד בעדינות את הרקמה הפנימית הרכה מן הגג של שריון הגב. שמור את המרית במגע עם שריון כדי למנוע נזק STNS. השתמש rongeurs להתנתק חלקי שריון אשר הופרדו הרקמה. כמו כן חלק נפרד הרקמות הרכות של שריון הגחון לוודא להפריד כל השרירים adductor הצמדת רקמות שריון.
- להתנתק שריון הגב כמו האחורי ככל הלב שבו יש שתי ossicles קטנה מבצבצת שריון. גזור ככל האפשר הקדמי. לייצב את Cephalon ("פנים") באצבע אחת תוך שבירת משם את החלקים הקדמי ביותר של שריון הגב.
- בצד הגחוני של שריון, לשלוף את הלסתות אחד בכל פעם, על ידי עיגון rongeurs על הלסת התחתונה, מסובב אותם החוצה כדי לסלק את הלסת התחתונה מן epistome המצורפת, ומשך אותה משם. שני ossicles ארוך עם שרירים יש לצרף הלסת התחתונה המחולץ אם נעשה כראוי.
- נפרדת ממנו את הרקמה מן הצדדים של Cephalon ליד העיניים בעזרת מרית. עם מספריים קטנים לנתיחה, חוצים הרקמה כמו ליד הרכס של ossicle כשכבת אפשרי אחר שכבה.
- הנח את סרטן בקיר המחבת לנתיחה ולהשעין אותו לאבטחת אותו במקום (מציפורני ניתן להשתמש לשם כך). חותכים את labrum ("השפה העליונה") הרחק epistome לוודא שלא להשאיר רקמה כלשהי המצורפת. שימוש עצם חיתוך מספריים בשני חתכים אלכסוניים לתוך שריון הגחון כדי להסיר את Cephalon.
- קח את labrum עם מלקחיים שיניים וחתך את labium ("השפה התחתונה") הרחק ossicle בצד הגחון. ואז בעדינות להרים את השפתיים הרחק שריון הגחון הנותרים. השתמש במספריים קטנים להפריד את החלק הגחוני של הקיבה מרקמת רירית שריון. כאשר ampullae השוער גלויים, לחתוך את הבטן מן הרקמה צידיו של אותו עד הבטן מופק הסרטן.
- עדיין מחזיק את הבטן על ידי השפה עם מלקחיים, שאר הקיבה בכף היד ושופכים מלוחים לתוך הפה. זה מרחיב את הקיבה ואת עושה את זה קל יותר לחתוך פתוח. גזור מפתיחת בפתחו מטה בין הזכות השוער דרך ossicle בין ampullae. ואז לחתוך באלכסון למטה דרך שני סניפים cardial. חותכים את קצות שלוש שיניים בתוך הקיבה.
- מניחים את הבטן על צלחת גדולה, שחורה Sylgard מצופה, עם החלק הפנימי של הבטן כלפי מטה. הצמד מטה חמש פינות להכנת סיכות חרקים למלא את המנה עם מלח קרים, לטבול ההכנה כולה (ראה איור 1).
2. פיין Dissection
- , Micro-לנתיחה כלים נדרשים לנתיחה את הקנס. בפרט, מלקחיים ומספריים באביב יש צורך, כמו גם בעל סיכה עם מחט טונגסטן. ברור, Sylgard מצופה, צלחת פטרי וכמה סיכות חוט דק צריך גם להיות מוכן.
- החל ההגדלה הנמוכה ביותר, התחל מצמיד את דשי ליד השפה שפעם פתיחת הפה. סידור מחדש של שאר הסיכות כדי הכנת מתוח סיכה כלשהו בתחומים אחרים הדרושים.
- הרם בזהירות את ובהיפודרמיס הבחין מכסה את החלק התחתון של הכנת וקוצצים אותו על פני להשאיר פיסת ובהיפודרמיס עם שתי נקודות לבנות.
- מקלפים את רקמת צהוב, דליל קרומי בתחתית ההכנה. Mvns מחוברים חלושות אל החלק התחתון של רקמה זו. בזהירות להפריד את mvns מרקמות הצהוב כפי שהיא עצרה. בצע את רקמת צהוב ולעקור לצד המוח.
- בצע את התהליכים עבה היציאה המוח להאריך laterallי ' אלה הם העצבים commisural. לאחר סוף עצב commissural הוא הגיע, להסיר את מסה של רקמה ספוגית מחוץ לבן, כי כבר לחתוך מהצד של המוח.
- איפה יוני ובניו לפגוש את גלגלי השיניים, לחתוך את השריר ורקמות לחשוף את אורכו של יוני ובניו.
- חזור אל התיקון ובהיפודרמיס הבחין ולנתק אותה. זה צריך להשאיר פתח בעורק המקיף את STG. חותכים דרך הפתח כדי להפריד בין שני שרירים כי האגף STG. הרם את הקצוות של שרירים אלה לחתוך ימינה מתחתם כדי להפריד בינם לבין העורק ולחשוף את alns ו agns. הפרד את השרירים איגוף עד למעלה כמו הסחוס שוכב על STN.
- לחתוך את הרקמה המקיפה את עורקי STG עד היכן mvns, dgn, ו dvn להיפגש. עבודה לאורך dvn את lvns לחתוך דרך רקמות, לבנבן עדין המכסה את lvns.
- אתר את PSN על ossicle באזור החלק התחתון של התכשיר. PSN ניתן להשתמש כדי לאתר את lvn וצומת dlvn.
- הבא אחרי dlvn מטה כדי לאתר את pyn ו PDN. Pyn לעתים קרובות כורך על ampulla השוער לפתיחה. PDN מזלגות מעל dlvn והוא בין ampulla השוער ואת השוער שרירים אירוביים שסתום. השאירו כמה שרירים המחוברים אחד העצבים האלה כי הם יכולים לבלבל בקלות כאשר ההכנה מועבר המנה Sylgard ברור.
- לאחר כל העצבים נחשפו, לנתק את כל הקשרים שנותרו בין STNS לבין רקמות לא רצויות העצבים של הקיבה. בזהירות להזיז את STNS רחוק משאר הקיבה, חיתוך כל הקשרים החמיץ.
- מצב את המנה Sylgard ברור עם המוני הנותרים של רקמת הקיבה על ידי שפשוף אותו על פני השטח של Sylgard עד Sylgard כבר לא מרגיש דביק מדי או יבש. Sylgard הוא הידרופובי STNS תדבק בחריפות את זה אם את המנה Sylgard מצופה אינו מותנה בדרך זו.
- מוסיפים קצת מלח קרים המנה. תפוס את הקצוות העליונים של העצבים commissural עם מלקחיים ולהביא את STNS כדי בצלחת Sylgard ברור.
- פין STNS מטה אל Sylgard. סבר המוח מן העצבים commissural ולהשתמש סיכות minuten כדי לאבטח את ארבעת הקצוות של גלגלי השיניים למטה הראשון. ודא כי הכנה נכונה כלפי מעלה על ידי סימון כי IVN היא מצביעה למעלה מן Sylgard. Dgn צריך לצאת מעט מתחת STG כאשר STG הוא בצד ימין למעלה. הצמד את שאר העצב מסתיים למטה עם סיכות חוט דק.
- נקה משם כל שנותר שריר או רקמה STNS.
- Desheath STG באמצעות בעל פינים ו מכור מעט, מחט בסדר, טונגסטן. עושים חור קטן בפינה של נדן STG הרחק גופי התא ולהשתמש חור כדי לקבל בין שכבות נדן. בזהירות לחתוך כנף של נדן מופרדות לחשוף את neuropil STG וגופים התא.
- פין כל דשי של נדן למטה כדי להגדיל את הנגישות הגופים התא כדי לייצב את STG עבור הקלטות תאיים. Re פינים שאר STNS להבטיח כי כל עצב מתוח היטב במרווחים הקלטה תאיים (ראה איור 3).
3. תוצאות
- באופן אידיאלי, כל העצבים צריך להיות חופשי של ניקס ואת הנזק, במיוחד אלה שיירשמו מ. אף אחד העצבים צריכה להיות סבוך או מעוות. STG צריך להיות שלם עם כל התאים מסודרים במבנה זקן סביב neuropil. STNS שלם סימטרית בילטרלי והן נראה כמו הננס עם lvns כמו הרגליים, mvns כמו הזרועות ואת הקצה הקדמי כראש.
קיצורים:
| STNS | מערכת העצבים Stomatogastric |
| STG | Stomatogastric גנגליון |
| בורג | Commissural גנגליון |
| OG | הוושט גנגליון |
| mvn | חדרית חציון עצב |
| יון | עצב הוושט Inferior |
| בן | עצב הוושט מעולה |
| AGN | עצב קיבה Anterior |
| AlN | עצב לרוחב Anterior |
| dgn | עצב קיבה הגבי |
| dvn | חדרית הגב עצב |
| lvn | חדרית Lateral עצב |
| PSN | הבטן Posterior עצב |
| pyn | השוער עצב |
| PDN | המרחיב השוער עצב |
| dlvn | סניף הגבי של העצב חדרית לרוחב |
| IVN | חדרית נחותים עצב |
איור 1: תרשים הממחיש את המיקום המשוער של STNS בבטן לפני לנתיחה.
איור 2: תרשים של שרירים שונים בחלק התחתון של הקיבה כיסוי של STNS של אור ירוק. כל סוג תא STG הוא מופיע עם השרירים הם ידועים innervate. מפה זו שימושית בעת תכנון לנתח עצב שנושא אותות מתא נתון (באדיבות מעבדה נדים).
איור 3: תרשים סכמטי של STNS עם אלקטרודות תאיים ובארות תאיים (מ 'מרדר ו בוכר, 2007).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
דיסקציה STNS היא הצעד הראשון בביצוע הניסוי electrophysiology או אימונוהיסטוכימיה, או לקבלת תאים תרבית תאים. ללא קשר הניסוי נועד, דיסקציה הגולמי יישאר ללא שינוי. עם זאת, דיסקציה הקנס עשוי להשתנות. חשוב לתכנן מראש של זמן שבו תאים אשר עצבים תוכלו להקליט. רוב הנוירונים STG יש תהליכים innervate אחד לפחות שרירים בבטן (ראה איור 2), מסווגים לפי innervated היעד שלהם. לפיכך, הקלטות תאיים נדרשים באופן מלא לאמת את זהות התא כי הוא מוקלט intracellularly. תדירות קצב של השוער וחוסנם משמשים כדי לפקח על הבריאות של התכשיר. לכן, ניסויים רבים כוללים הקלטות מן lvn תאיים. Dgn משמש בדרך כלל כדי לפקח על קצב קיבה. STN היא לעתים קרובות חיונית ביותר בניסויים כי יש תאים רבים modulatory בסוף הקדמי של STNS וניתוק כי העצב עלול לגרום המקצבים השוער ובקיבה לחדול או להיות לא סדיר.
אף על פי הסדר שבו השלבים לנתיחה הקנס נעשים לא חשוב, אנחנו מוצאים את זה קל יותר להסיר את STNS ללא נזק על ידי שמירה על קצות העצבים ההיקפיים מעוגנים השריר עד לאחר STG נותק מן המקיפים רקמות. פעולה זו שומרת על מספיק STG ו STN מתוח בבטחה ובקלות להסיר את השרירים ואת הרקמה הסובבת אותם.
לאחר ההכנה הוא בצלחת Sylgard ברור, רקמה כל שנותר על STNS יש להסיר כדי למנוע הפרעה עם האלקטרודות במהלך ניסוי. זה גם קל יותר לקבל טוב, הקלטות יציבה כאשר היא הכנה מרותקים כמו מתוח ככל האפשר ללא גרימת נזק לעצבים. זה חשוב במיוחד כי STG להיות מרותקים מאובטח על ידי alns עם סיכות קצר לספק גישה אלקטרודות אל תאיים כמו תאים רבים ככל האפשר. עדיף לנתח את לפחות חלק כלשהו של העצבים שמקורם STG, גם אם אלה עצבים לא נחוצות עבור ההקלטה. הם יכולים לספק עוגנים תוספת נוספת לייצוב STG על המנה. עדיף להשאיר אותם קצר למדי עבור תמיכה מקסימלית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
בהכרת תודה אנו מודים לחברי מעבדת מרדר. אנו מודים יועץ שלנו, ד"ר איב מרדר, על התמיכה והעידוד שלה. מחקר זה מומן על ידי המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ מענקים NS-17813 ו - NS-058110.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Black Sylgard 170 | Other | Dow Corning | 170 | Gross Dissection |
| Fine Scissors | Surgery | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Insect Pins size 6 | Surgery | Fine Science Tools | 26000-65 | |
| Mayo Scissors | Surgery | Fine Science Tools | 14110-17 | |
| Micro-Spatula | Surgery | WARD’s Natural Science | 15 V 4313 | |
| Rongeurs | Surgery | Fine Science Tools | 16000-14 | |
| Tissue Forceps | Surgery | Fine Science Tools | 11021-12 | |
| Fine Tungsten Wire (0.001 in. diameter) | Surgery | California Fine Wire Company | Fine Dissection | |
| Forceps #5 | Surgery | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Minuten Pins | Surgery | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Moria Spring Scissors (7mm blades) | Surgery | Fine Science Tools | 15370-52 | |
| Petri Dish (100x15mm) | Other | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Pin Holder | Surgery | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| Super fine forceps #5SF | Surgery | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Sylgard 182 | Other | Dow Corning | 182 | |
| Tungsten Needles | Surgery | Fine Science Tools | 10130-05 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Wild | MC3 | Misc. |
| Jonah Crab (C. borealis) | Animal | Commercial Lobster |
References
- Harris-Warrick, R. M., Marder, E., Selverston, A. I., Moulins, M. Dynamic Biological Networks: The stomatogastric nervous system. , MIT Press. Boston. (1992).
- Marder, E., Bucher, D. Understanding circuit dynamics using the stomatogastric nervous system of lobsters and crabs. Annu. Rev. Physiol. 69, 291-316 (2007).
- Maynard, D. M., Dando, M. R. The structure of the stomatogastric neuromuscular system in Callinectes sapidus, Homarus Americanus and Panulirus argus (Decapoda crustacean). Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 268 (892), 161-220 (1974).
- Selverston, A. I., Russell, D. F., Miller, J. P. The Stomatogastric Nervous System: Structure and function of a small neural network. Prog. Neurobiology. 7, 215-290 (1976).
