Summary
Jonah yengeç stomatogastric sinir sistemi (STNS) (
Abstract
Iyi karakterize bir hücre nispeten az sayıda (yaklaşık 25 C borealis) içerdiğinden stomatogastric ganglion (STG), hücresel ve ağ etkileşimleri çalışmak için mükemmel bir model . STG hücreler çıkışları geniş bir sergi ve mide motor eylemler için sorumludur. Mide, üç iç dişleri ile gıda ve gıda midgut ulaşmadan önce filtreler pyloru parçalayan gastrik değirmen içerir. STG merkezi desen jeneratörleri (CPG'lerin hepsi aynı) olarak bilinen mide değirmen ve pyloru kontrol etmek için iki ritmik çıkışları üretir. STG Her hücre bu ritimleri birini veya her ikisini katılabilir. Bu CPG'lerin nöromodülasyon çalışmada, homeostazı, hücresel ve ağ değişkenlik, ağ geliştirme ve ağ kurtarma için izin verir.
Jonah yengeç (Kanser borealis) stomatogastric sinir sistemi (STNS) diseksiyonu iki parça halinde yapılır; kaba ve ince diseksiyon. Brüt diseksiyon tüm mide yengeç disseke edilir. Ince diseksiyon sırasında STNS mide bir diseksiyon mikroskobu ve mikro diseksiyon araçları (bkz. Şekil 1) kullanılarak elde edilir. STNS STG, özofagus ganglion (RG) ve commissural ganglionlar (cog) yanı sıra mide kasları innerve sinirleri içerir. Burada, ekstrasellüler kayıtları için kullanılan olurdu STG hücrelerin intraselüler ve periferik sinirleri kaydedilen olacak bir elektrofizyoloji deney için hazırlık STNS tam bir diseksiyon nasıl göstermektedir. Somata ve neuropil ortaya çıkarmak için ganglion desheathing bizim teknik olarak istenilen sinirler bulmak için uygun tekniği de gösterilmiştir.
Protocol
1. Brüt Diseksiyon
- Hayvan donuk duyu ve motor sistemlerinin 30 dakika boyunca buz üzerinde bir yengeç yerleştirin. Buz ile her tarafta onu çevreleyen. Yengeç Kullanım sırasında eldiven giyilmelidir.
- Diseksiyonu pan ve kullanacağınız araçları dışarı atarken brüt diseksiyon için hazırlayın. Rongeurs, kemik kesme makası, küçük makas, dişli forseps, konik kenarı ile spatula, siyah Sylgard kaplı çanak, ve böcek pimleri ihtiyaç vardır.
- Sıkışmasını önlemek ve diseksiyon tavada yerleştirmek için, arka bacak buz kovası yengeç çıkartın.
- Içe her bir büküm ilk pençeleri çıkarın. Sonra aynı büküm hareketi her bacak kaldırmak.
- Rongeurs kullanarak, ağız kapsayan maksilla çıkarın. Ayrıca yumuşak maxillule çıkarın.
- Rongeurs kullanarak tekrar karapaksla lateral posterior sonundan itibaren başlamak ve bunun kenar iyi bir kavrama olsun. Kelepçe rongeurs ile aşağı ve karapaksla bir parça kesiyorum. Spatula açılış girmesi için yeterli karapaksta kaldırmak için emin olun. Gözleri karapaksla kenarından yukarı kaldırarak, diğer tarafta devam edin ve işlemi tekrarlayın.
- Spatula sivri tarafı hafifçe dorsal karapaksla çatı uzak yumuşak iç dokusu kazımak. Spatula STNS zarar görmesini önlemek için karapaksta ile temas halinde tutun. Rongeurs dokusundan ayrılmış karapaksla parçaları kurtulmak için kullanın. Ayrıca bazı yumuşak doku karapaksla doku ekleme adduktor kasları ayrı emin olun ventral karapaksla ayırın.
- Karapaksta çıkıntılı iki küçük kemikçikler vardır kalbinde kadar posterior dorsal karapaksla Break Away. Gibi çok ön mümkün olduğunca kesin. Dorsal karapaksla en ön parça terkedip Cephalon ("yüz") bir parmak ile sabitleyin.
- Karapaksla ventral tarafta, onlara ekli epistome mandibula çıkarmak için dışa büküm ve dışarı çekerek, mandibula üzerine rongeurs demir bir zamanda çene kemiklerini bir çekin. İki kasları ile uzun kemikçikler, doğru yapılırsa Ayıklanan mandibula eklenmelidir.
- Spatula ile Gözlere yakın Cephalon iki doku ayırın. Doku tabakası tarafından, olası bir katman olarak kemik parçası sırt yakın kesen küçük diseksiyon makas.
- Diseksiyonu pan bir duvara yengeç istirahat ve yerine o güvenliğini (pençeleri için kullanılan olabilir) desteklemek. Herhangi bir doku eklenmiş bırakmamaya dikkat ederek epistome uzak labrum (üst dudak) kesin. Kemik kesme makası kullanarak Cephalon kaldırmak için ventral karapaksla iki diyagonal kesimler yapmak.
- Dişli forseps ile labrum ve ventral tarafta kemik parçası uzak labium ("alt dudak") kesmek. Sonra yavaşça kalan ventral karapaksla uzak dudak kaldırma. Karapaksla döşeyen doku mide ventral kısmı ayırmak için küçük makas kullanın. Mide yengeç çıkarılan kadar pilorik ampullae görünür olduğunda, bunun her iki tarafta doku uzak mide kesmek.
- Yine de, elin avuç içi karşı mide dinlenme ve ağız içine tuzlu su dökün, forseps ile dudak mide tutarak. Bu mide genişler ve daha kolay açık kesmek için yapar. Aşağı pilorusta ampullae arasındaki kemik parçası ile sağ arasındaki ağız açılması kesin. Sonra iki Kardiyal şubeleri aracılığı ile çapraz aşağı kesti. Mide içinde üç diş ipuçları kesti.
- Mide aşağı mide içinde büyük, siyah, Sylgard kaplı tabağa yerleştirin. Beş köşeli hazırlık böcek iğneli pin ve çanak tüm hazırlık çeker (bkz. Şekil 1), soğuk tuzlu su ile doldurun.
2. İnce Diseksiyon
- , Mikro-disseksiyon araçları ince diseksiyon için ihtiyaç vardır. Özellikle, forseps ve yaylı makas tungsten iğne ile bir iğne tutucu yanı sıra ihtiyaç vardır. Net, Sylgard kaplı petri ve bazı ince tel pimleri da hazırlanmış olmalıdır.
- En düşük büyütme başlayarak, ağız açıklığı için kullanılan dudak yakın kapakları aşağı iğneleyerek başlar. Hazırlık gergin yapmak ve diğer alanlarda gerekli her türlü pin pimleri geri kalanı yeniden düzenleyin.
- Hazırlık alt kısmını kapsayan benekli hipodermis dikkatlice kaldırın ve iki beyaz nokta ile hipodermis bir yama bırakarak üzerinden bunu düzeltin.
- Hazırlanması alt yakın sarı, bir tutam, membranöz doku kadar soyun. Mvns zayıf bu doku alt bağlıdırlar. O kadar çekilir gibi sarı doku dikkatlice mvns ayırın. Sarı doku takip ve beyin yanında kesmek.
- Beyin çıkmadan kalın süreçlerini takip uzatmak laterally Bunlar commisural sinirler vardır. Commissural sinir sonuna ulaşıldığında, beynin yan uzak kesilmiş, off-beyaz süngerimsi doku kitle çıkarın.
- Iyonları ve oğulları Cogs buluştuğu yer, iyonları ve oğulları uzunluğu ortaya çıkarmak için kas ve doku kesip.
- Benekli hipodermis yama dönün ve kesti. Bu STG çevreleyen arter bir açıklık bırakmanız gerekir. , Iki kaslar bu kanadını STG ayrı delikten kesin. Bu kasların uçları yukarı kaldırın ve sağ kesim, onları arter ayırmak için alns ve agns maruz altında . Stn üzerinde uzanan kıkırdak olarak kadarıyla yan kasları ayırın.
- Mvns, dgn STG aşağı çevreleyen arter doku kesilip, dvn karşılamak. Lvns dvn Çalışma ve lvns kaplayan beyaz, narin doku kesti.
- Psn hazırlanması alt yakın kemik parçası üzerinde bulun. Psn LVN ve dlvn kavşak bulmak için kullanılabilir.
- Sonraki pyn ve PDN bulmak için dlvn izleyin. Pyn sık sık açılması pilorik ampulla üzerine sarar. PDN dlvn çatal kapalı ve pilorik ampulla ve kardiyo pilorik valf kasları arasındadır. Hazırlık net Sylgard çanak transfer edildiğinde kolayca karışabilir, çünkü bu sinirlerin bağlı bazı kas bırakın.
- Bir kez tüm sinirlerin STNS ve mide, doku ve istenmeyen sinirler arasında kalan herhangi bir bağlantıları, sever ortaya edilmiştir. Dikkatli bir şekilde, herhangi bir cevapsız bağlantıları kesme, mide geri kalanı uzakta STNS hareket.
- Sylgard artık çok yapışkan ya da kuru hissedene kadar Sylgard yüzey üzerinde sürtünme mide dokusu kalan kitle ile açık Sylgard çanak durumu. Sylgard hidrofobik ve Sylgard kaplı çanak bu şekilde şartlandırılmış değilse STNS kuvvetle uyacaktır.
- Çanak bazı soğuk tuzlu su ekleyin. Forseps ile commissural sinirlerin üst ucunu alın ve STNS açık Sylgard çanak getirmek.
- STNS Sylgard üzerine sabitleyin. Commissural sinirler beyin Sever ve Minuten pimleri Cogs dört ucu aşağı ilk sabitlemek için kullanabilirsiniz. Hazırlık IVN Sylgard uzak işaret olup olmadığını kontrol sağ tarafında olduğunu emin olun. STG sağ taraftaki dgn STG altında biraz çıkmalısınız. Sinirin geri kalanı Pin aşağı ince tel iğneler ile sona erer.
- STNS kalan kas veya doku temizleyin.
- Desheath bir iğne tutucu ve biraz bağladım, ince, tungsten iğne kullanarak STG. STG kılıf hücre gövdeleri uzak bir köşesinde küçük bir delik açın ve bu delik kullanmak kılıf katmanları arasındaki almak için. STG neuropil ve hücre organları açığa çıkarmak için ayrılmış bir kılıf kapağı dikkatlice kesin.
- Hücre gövdeleri erişilebilirlik artırmak ve hücre içi kayıtları için STG stabilize etmek için aşağı kılıfı herhangi bir flep Pin. Her sinir gergin ve ekstraselüler bir kayıt (bkz. Şekil 3) aralıklı sağlanması STNS geri kalanı Re-pin.
3. Sonuçlar
- İdeal olan, tüm sinirlerin özellikle çizik ve hasar, kaydedilmiş olacak olanlar ücretsiz olmalıdır. Sinirlerin Yok karışık veya bükülmüş olmalıdır. STG neuropil etrafında bir sakal oluşumu düzenlenen tüm hücrelerin sağlam olmalıdır. Sağlam STNS bilateral simetrik ve bacaklar, kollar ve kafa olarak ön uç olarak mvns lvns bir minyatür gibi görünüyor.
Kısaltmalar:
| STNS | Stomatogastric sinir sistemi |
| STG | Stomatogastric ganglion |
| COG | Commissural ganglion |
| RG | Özofagus ganglion |
| mvn | Ortalama ventriküler sinir |
| iyon | İnferior özofagus sinir |
| oğlum | Üstün özofagus sinir |
| AGN | Ön mide sinir |
| Aln | Anterior lateral sinir |
| dgn | Dorsal mide sinir |
| dvn | Dorsal ventriküler sinir |
| LVN | Lateral ventrikül sinir |
| psn | Arka mide sinir |
| pyn | Pilorik sinir |
| PDN | Pilorik dilatör sinir |
| dlvn | Lateral ventrikül sinirin dorsal dalı |
| IVN | İnferior ventriküler sinir |
Şekil 1: diseksiyon önce mide STNS yaklaşık yerleştirme gösteren diyagram.
Şekil 2:, açık yeşil, mide ve STNS bir yerleşim alt kısmı çeşitli kasların Diyagramı . STG her hücre tipi kasları innerve bilinen listelenir. Bu harita, planlama, belirli bir hücre (nezaket Nadim laboratuar) bir sinyal taşıyan sinir incelemek yararlı olacaktır.
Şekil 3: STNS, hücre içi elektrotlar ve hücre dışı kuyu (Marder ve Bucher, 2007) ile şematik .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
STNS diseksiyonu bir elektrofizyoloji veya immünohistokimya deney, ya da hücre hücre kültürü elde etmek için yerine ilk adımdır. Amaçlanan deney ne olursa olsun, brüt diseksiyon değişmeden kalır. Ancak, ince diseksiyon değişebilir. Öncesinde kayıt hücreleri ve sinirler zaman planı için önemlidir. STG nöronların çoğu mide en az bir kas innerve (bkz. Şekil 2) ve innerve hedef göre sınıflandırılır süreçleri var. Bu nedenle, ekstraselüler kayıtları tam intraselüler kaydedilmiş olan bir hücre kimliğini doğrulamak için gereklidir. Pilorik ritm frekansı ve sağlamlık hazırlık sağlığını izlemek için kullanılır. Bu nedenle, birçok deneyler LVN ekstrasellüler kayıtları içerir . Dgn genellikle mide ritmi izlemek için kullanılır. STNS ön sonunda birçok düzenleyici hücreleri ve bu sinir kesilmesinin pilorik ve mide ritimleri düzensiz ateşkes veya haline neden olabilir, çünkü istasyonlarda sık sık en deneyler için çok önemlidir.
STG çevredeki kesildikten sonra kadar ince diseksiyon adımları sırayla yapılır önemli olmasa da, biz daha kolay zarar vermeden kas demirlemiş periferik sinirlerin ucundan tutarak STNS kaldırmak için doku. Bu, güvenle ve kolaylıkla onları çevreleyen kas ve doku kaldırmak için STG ve stn gergin yeterli tutar .
Hazırlık net Sylgard çanak sonra, STNS kalır herhangi bir doku, bir deney sırasında elektrot ile bir girişimi engellemek için çıkarılmalıdır. Bu hazırlık sinirlere zarar vermeden, mümkün olduğu kadar gergin olarak aşağı tuş zaman iyi, istikrarlı kayıtları almak için de daha kolaydır. STG, mümkün olduğu kadar çok hücreler olarak intrasellüler elektrotlar erişim sağlamak için kısa iğneli alns güvenli bir şekilde aşağı tutturulmuş olması özellikle önemlidir . Bu sinirlerin bu sinirler kayıt için gerekli olmasa bile STG kaynaklanan herhangi birinin en azından bir kısmını incelemek için tercih edilir. Onlar daha da dengeleyici çanak STG ekstra çapa sağlayabilir. Maksimum destek için oldukça kısa tutmak en iyisidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz minnetle Marder Lab üyeleri kabul etmiş oluyorsunuz. Danışmanı Dr. Havva Marder, Biz ona destek ve cesaret için teşekkür ederim. Bu araştırma, Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Hibeler NS-17.813 ve NS-058.110 Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Black Sylgard 170 | Other | Dow Corning | 170 | Gross Dissection |
| Fine Scissors | Surgery | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Insect Pins size 6 | Surgery | Fine Science Tools | 26000-65 | |
| Mayo Scissors | Surgery | Fine Science Tools | 14110-17 | |
| Micro-Spatula | Surgery | WARD’s Natural Science | 15 V 4313 | |
| Rongeurs | Surgery | Fine Science Tools | 16000-14 | |
| Tissue Forceps | Surgery | Fine Science Tools | 11021-12 | |
| Fine Tungsten Wire (0.001 in. diameter) | Surgery | California Fine Wire Company | Fine Dissection | |
| Forceps #5 | Surgery | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Minuten Pins | Surgery | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Moria Spring Scissors (7mm blades) | Surgery | Fine Science Tools | 15370-52 | |
| Petri Dish (100x15mm) | Other | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Pin Holder | Surgery | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| Super fine forceps #5SF | Surgery | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Sylgard 182 | Other | Dow Corning | 182 | |
| Tungsten Needles | Surgery | Fine Science Tools | 10130-05 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Wild | MC3 | Misc. |
| Jonah Crab (C. borealis) | Animal | Commercial Lobster |
References
- Harris-Warrick, R. M., Marder, E., Selverston, A. I., Moulins, M. Dynamic Biological Networks: The stomatogastric nervous system. , MIT Press. Boston. (1992).
- Marder, E., Bucher, D. Understanding circuit dynamics using the stomatogastric nervous system of lobsters and crabs. Annu. Rev. Physiol. 69, 291-316 (2007).
- Maynard, D. M., Dando, M. R. The structure of the stomatogastric neuromuscular system in Callinectes sapidus, Homarus Americanus and Panulirus argus (Decapoda crustacean). Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 268 (892), 161-220 (1974).
- Selverston, A. I., Russell, D. F., Miller, J. P. The Stomatogastric Nervous System: Structure and function of a small neural network. Prog. Neurobiology. 7, 215-290 (1976).
