בנקאות המוח דגימה שיטתית של חומר ביולוגי מספק את הבסיס stereology משוחדת למקסימום את פוטנציאל נתונים המתקבלים הדגימה כל אחד.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
Stereology משוחדת היא שיטה מדויקת ויעילה לאמוד את מספר נוירון הכולל (או סוג תא אחר) באזור מסוים של עניין
פרוטוקול
חלק 1: טרום עיבוד של רקמות
- רקמות צריך להיות perfused היטב עם paraformaldehyde, glutaraldehyde, או פורמלין. זו יכולה להיות מושגת באמצעות זלוף transcardial הסטנדרטית המשמשת בדרך כלל כדי לקצור איברים אחרים. במחקר הנוכחי הנושא היה מורדמת עם קטמין הידרוכלוריד (10 מ"ג / ק"ג, IM), מורדמים עם ממנת יתר של pentobarbital נתרן (25 מ"ג / ק"ג, ד) ו perfused transcardially עם 0.1 מ PBS עד exsanguinated לחלוטין. זה ואחריו פתרון paraformaldehyde 4% PBS דקות 5 (~ 1 ליטר).
- המוח צריך להיות חסום stereotaxically, להסיר הגולגולת, שקל, ונפח נחוש 2. רקמה אמור להיות cryoprotected בפתרונות סוכרוז מדורגים עם ריכוז סופי של סוכרוז 30% חיץ פוספט. גושי רקמה אמור להיות קפוא isopentane ב -65 ° C ו המאוחסן ב -80 ° C עד שאתה מוכן לחתוך.
חלק 2: דגימה שיטתית
- דגימה שיטתית מסתמך על תוכנית ראויה לפני חתך. האזור כולו של עניין הן את גודל מקורי, הזנב ואת הגב, הגחון צריך להיות מוגדר היטב. אטלס stereotaxic של המין בשימוש עוזר להגדיר את האזור של הריבית כדי לקבוע את אורך האזור של עניין. לאחר אורך האזור של עניין נקבע יש צורך להקים את מרווח הדגימה. לדוגמה, מאטלס stereotaxic לך לקבוע כי היקף כולו rostro-הזנב של האזור של עניין הוא כ 3 מ"מ אורך, כאשר חתך במישור העטרה. לאחר מכן אתה מחליט להגדיר את cryostat סעיף ב 50μm, בקצב הזה יהיה לך 60 סעיפים המכסים את היקף מקורי, הזנב של האזור של עניין. לצורך המחקר טיפוסי stereological משוחדת 6-10 חלקים שנדגמו באופן שיטתי נדרשים לקבל תוצאות אמינות. בדוגמה זו 10 סעיפים ברווחים שווים לאורך כל תוצאה rostro-הזנב היקף במרווח דגימה של 1 / 6 חלקים.
חלק 3: יצירה של הבנק המוח
- לאחר תדר הדגימה סעיף נקבע, הצעד הבא הוא לקבוע איזה כתמים יבוצע מיד. לדוגמה, אם אתה מכתים עם סגול cresyl תוכלו לתפוס 1 / 6 חלקים בשקופית. זו תהיה סדרה 1. אם אתה יודע אולי יש נוגדנים פוטנציאל כמה שאתה רוצה לרוץ, אבל גם רוצה לראות את הנתונים מספק כתם הראשי שלך או פשוט אין לך את הזמן כדי לבצע את אימונוהיסטוכימיה, במקום סדרה הנותרים 5 סעיפים כדי שהם היו פרוסים לשמר אנטיגן בארות המכיל (1 פוליוויניל% pyrrolidone, אתילן גליקול 50% o.1M PBS, Ph 7.4). הטבלה שלהלן מספקת תוכנית דגימה המורכב שקופית 1 ו 1 צלחת (צלחת 48-היטב רגיל) סעיפים כחלק הבנק מוח (טבלה 1).
טבלה 1. הדגימה סעיף תדר כאן הוא 1 / 6. בסעיף הראשון מושם על שקופית עבור מכתים סגול cresyl ולמחרת 5 סעיפים ממוקמות לתוך אנטיגן לשמר. מספר סעיף 7 הוא נתפס אז בשקופית וחתכים 9-12 ממוקמים אנטיגן לשמר. מחזור זה חוזר על עצמו עד לאזור של עניין או בלוק של רקמות מחולק ממצה. - השלב הבא הוא סעיף ממצה את גוש של רקמה. מניחים כמות קטנה של הטבעה בינוני על צ'אק ולתת לו להקפיא. מניחים את צ'אק לתוך הראש microtome ו לגלח מספיק של המדיום קפוא יש משטח שטוח. הסר את צ'אק מהראש microtome מקום שטוח בתוך cryostat. יוצקים הטבעה בינוני על צ'אק ועל בתוקף במקום לחסום את המוח עם הצד החתוך stereotaxically ממוצבת ביובש על צ'אק. לאט לחלוטין להטביע את המוח הרכבה בינונית. מניחים את צ'אק עם המוח לתוך הראש microtome וסעיף באמצעות פרמטרים שנקבעו מראש עבור תדר הדגימה סעיף.
- לאחר בלוק של רקמות כבר מחולק ממצה וחתכים ממוקמות לתוך בארות, מכסים את הצלחת עם מכסה, עוטפים את המכסה עם parafilm, ומכניסים למקפיא -20 מעלות צלזיוס. התחבר המספר הכולל של החלקים שצולמו עבור כל סדרה, רווח בסעיף הדגימה, ומספר הסדרה עבור כל חיה. יומן זה יהיה חיוני כדי לעקוב אחר הסרת הבאות של חלקים מהבנק המוח אימונוהיסטוכימיה בעתיד.
חלק 4: תוצאות נציג:
דגימה שיטתית באופן זה כבר מקובל במעבדה שלנו במשך 3 השנים האחרונות. היו לנו הרבה הצלחה בביצוע אימונוהיסטוכימיה על החומר אוחסן ב אנטיגן לשמר שלוש שנים אחרי זה היה פרוס ללא הידרדרות של האות (איור 1). יתר על כן, כחלק הבנק המוח שלנו יש לנו מחובר קרוב ל 20,000 חלקים שיטתית של הלא אנושיהמוח הפרימטים (איור 2) במסגרת תוכניות לטווח ארוך המחקר שלנו. 
באיור 1. זהו קטע מן המוט העורפית של פרימטים לא אנושיים immunostained עבור NeuN מראה הן שכבה VI ו ביניים נוירונים החומר הלבן. סעיף זה בפרט אוחסן אנטיגן לשמור על -20 מעלות צלזיוס למשך תקופה של 2 שנים. בר סולם = 100μm. 
איור 2. Vervet הבנק המוח שלנו מורכב כיום קרוב ל 20,000 חלקים שיטתית מ 30 קופים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
דגימה שיטתית היא שיטה זולה שנועדה למקסם את חומר מחקרי. אסטרטגיה זו הדגימה נועדה לציית לכללי stereology משוחדת הדורש דגימה שיטתי ברחבי האזור. זה קריטי, כי את סדר הסעיפים עבור כל סידרת נשמר. במעבדה שלנו השתמשנו בהצלחה בשיטה זו עבור הבנקאות הן אוגר והלא אנושי חלקים במוח הפרימטים. עד כה אספנו חלקים במוח קרוב ל 20,000 קוף vervet (Chlorocebus aethiops sabeus) ובאופן שגרתי לבצע immunohistochemisty על סעיפים שאוחסנו במשך למעלה משנה. היתרונות של הבנק היטב המאופיינת במוח כוללים את ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.
תודות
המחברים מבקשים להודות Ikiel Ptito לקבלת תמיכה טכנית המשיכה שלו.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| אתילן גליקול (Ethylene glycol) | Fisher Scientific | E178-4 | |
| פוליביניל פירולידון (Polyvinyl pyrrolidone) | Fisher Scientific | BP431-500 | |
| תווך שיכון תרמי (Thermal Scientific Embedding Medium) | Fisher Scientific |
מקורות
- West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Aat Rec. 231, 482-497 (1991).
- Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space. J Vis Exp. , (2009).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
