Summary
Großflächige Immundetektion der Zielproteine in der gesamten Primatengehirn wird durch den Einsatz von neuartigen Gewebe Einbettung und Schneiden Methoden mit dem Einsatz von kreativen Apparat für Batch-Färbung von mehreren frei schwebenden Abschnitte zu einem bestimmten Zeitpunkt in Kombination möglich.
Abstract
Immunhistochemie (IHC) ist eine der am häufigsten verwendeten Labor-Techniken für die Detektion von Target-Proteinen
Protocol
Immunohistochemisty ist eine der am häufigsten verwendeten Techniken zur Charakterisierung von Protein-Expression im Gehirn von verschiedenen experimentellen Tiermodellen. Es ist relativ leicht zu systematischen immunhistochemischen Verfahren auf die Gehirne der Nagetiere und andere gemeinsame experimentelle Modelle mit ähnlicher Größe des Gehirns führen. Allerdings gibt es keine veröffentlichten Arbeit, unser Wissen, dass eine umfassende Darstellung, wie die zur Durchführung dieser Immundetektion Verfahren im gesamten Affenhirn bietet. Was folgt, ist eine detaillierte Beschreibung, wie eine ganze Affenhirn für großflächige immunhistochemischen Nachweis von verschiedenen Zielproteine vorzubereiten. Diese Arbeit wurde als Ergebnis der Zusammenarbeit zwischen kommerziellen und akademischen Bemühungen entstanden. Als solche Einzelheiten im Zusammenhang mit Gewebe Einbettung und Schneiden ein proprietäres Wissen NSA bleiben.
Teil 1: Animal Behandlung und Gewebe Vorbereitung
Das Gehirn eines Erwachsenen grünen Meerkatze (Cercopithecus aethiops) ist für das vorliegende Protokoll verwendet. Alle Verfahren sind in Übereinstimmung mit den Canadian Council on Animal Care (CCAC) Richtlinien für die Nutzung und Pflege von Tieren in der biomedizinischen Forschung 1 durchgeführt.
- Tiere ist tief mit Ketaminhydrochlorid (10 mg / kg, im), mit einer Überdosis Natrium-Pentobarbital (25 mg / kg, iv) und perfundierten transkardial mit 0,1 M PBS, bis sie vollständig ausgeblutet eingeschläfert sediert.
- Dies wird durch eine 4% Paraformaldehyd-Lösung in PBS für 5 min (~ 1 Liter) folgten.
- Die ausgelagerten Gehirn ist in abgestuften PBS-gepufferte Saccharose-Lösungen (10, 20 und 30%, in der Reihenfolge) mit 0,02% Natriumazid gelegt und bei 4 ˚ C, bis das Gehirn sinkt auf den Boden des Behälters. Die Lösung ersetzt wird alle paar Tage, bis Gehirn durchläuft Gefrier-Schnitte.
- Zu ihren proprietären MultiBrain unterzogen werden ™ Einbettung und Frost-Schneiden-Technologie; Das Gehirn ist in den Neurowissenschaften Associates (Knoxville, TN NSA) gesendet.
- Sieben (7) Ausrichtung Sehenswürdigkeiten sind in der Einbettungsmatrix platziert, so dass Abschnitte werden korrekt ausgerichtet (dh links-rechts-Orientierung) und neu ausgerichtet nach histologischen Verarbeitung abgeschlossen ist.
- Der gefrorene Block wird digital auf den Block Gesicht fotografiert vor jedem seriellen Abschnitt aus dem Block gesammelt wird. Digitale Bilder sowie Teile von diesem Gehirn kann später zur 3D-Rekonstruktion der anatomischen und histologischen Karten verwendet werden, bzw..
- Serielle frei schwebenden koronalen Abschnitte, bei einer Dicke von 50 um pro Abschnitt werden aus dem gesamten Gehirn gesammelt.
Teil 2: Histologische Bearbeitung
Die Schnitte werden in einem bestimmten räumlichen Abstand gewählt (zB 500-um) und für unsere experimentelle Zwecke wurden mit den folgenden Antikörpern verarbeitet: fragile-X mentale Retardierung Protein (FMRP; Chemicon; Temecula, CA), SMI32 (Sternberger Monoklonale Antikörper Inc.; Baltimore, MD) und NeuN (Chemicon; Temecula, CA). FMRP ist ein zytoplasmatische Protein, das reichlich in den Nervenzellen von normalen und Permutation Träger Gehirne 2 gefunden. NeuN (Neuronal Nuclei) erkennt spezifisch die DNA-bindende Neuronen-spezifische Protein NeuN die in den meisten Neuronen ist und in neuronalen Kerne, Perikarya und einige proximalen neuronale Prozesse 3 verteilt. SMI-32 ist ein monoklonaler Antikörper, der die nicht-phosphorylierten Epitop auf Neurofilament Proteinen 4 erkennt.
- Im Abstand von 500 um, sind etwa 140 Teile pro Antikörper verwendet.
- Alle Inkubationen, Waschungen und Färbungen Schritte werden mit leichtem Rühren mit spezialisierten Färbung Schüsseln und Körbe (; Knoxville, TN HistoTools) durchgeführt.
- Die Schnitte werden zunächst in einer Lösung mit 0,1 M PBS/0.3% Triton X-100 (TX) / 5% normal heiser Serum (NHS) für 60 min, um unspezifische Bindung von Antikörper-Moleküle und die daraus resultierenden Hintergrundfärbung zu reduzieren inkubiert.
- Abschnitte für FMRP Immunfärbung markiert durchlaufen einen zusätzlichen Schritt der Antigen Wiederherstellung mithilfe Antigen Demaskierung Solution (Vector Labs, Burlingame, CA) nach Anweisungen des Herstellers.
- Abschnitte werden dann über Nacht inkubiert und an unterschiedlichen Tagen in den jeweiligen Antikörper-Lösungen, die 0,1 M PBS/0.3% TX / 3% NHS (mit einem Verdünnungsfaktor von 1 / 5, 000 für FMRP und SMI-32 und 1 / 2, 000 für NeuN Antikörper.
- 1 /; Am nächsten Tag sind die Abschnitte für die drei 10-min Perioden in Waschlösung (0,1 M PBS/0.3% TX) durch Inkubation für 2 h bei Raumtemperatur in biotinylierten Anti-Maus-sekundären Antikörper in Pferd angehoben (Vector Labs gewaschen, gefolgt 1000 Verdünnung in 0,1 M PBS/0.3% TX / 3% NHS).
- Nach einem weiteren Satz von 3 10-min wäscht, sind die Abschnitte in einer Lösung aus Avidin-Biotin-konjugierte Meerrettichperoxidase-Komplex (Vector Labs) für 1 h bei Raumtemperatur gegeben.
- Endlich, nach einem anderen Satz von wäscht, sind die Abschnitte für 10 min auf eine Nickel verbesserte dia unterzogenminobenzidine (Ni-DAB) Reaktion, die ein dunkelblaues innerhalb immunreaktiven Neuronen Fleck produziert.
- Nach Abschluss der histologischen Verfahren, sind Abschnitte auf Gelatine-beschichteten Glasträger montiert.
- Alle Abschnitte sind über Nacht luftgetrocknet und mit einem Deckglas nach Standardverfahren.
Teil 3: Repräsentative Ergebnisse:
Diese Methode produziert eine komplette Expressionsprofil eines Zielproteins von Interesse im gesamten Affenhirn. Hier zeigen wir repräsentative koronalen Abschnitte, die eine Momentaufnahme der FMRP, NeuN und SMI32 Ausdruck in der gleichen Affenhirn bieten.
Abbildung 1: Die Färbung Schale (A) und Korb (B) für eine groß angelegte Batch-Verarbeitung der im Streubesitz befindlichen Abschnitte für Immundetektion verwendet.
Abbildung 2: Repräsentative koronalen Abschnitte aus einer grünen Meerkatze Gehirn für FMRP (A), NeuN (B) und SMI32 (C) Antikörper gefärbt.
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Discussion
Es gibt zwei kritische Schritte in diesem Verfahren, dass groß angelegte Nachweis von Proteinen in einer ganzen Affenhirn möglich zu machen. Eine davon ist die Einbettung und Schneiden-Protokoll, das die proprietäre Wissen NSA bleibt. Die andere ist die Verwendung der Färbung Schüsseln und Körbe von HistoTools zur Verfügung gestellt. Letzteres ermöglicht eine einfache und schnelle Handhabung von vielen (~ 40) Abschnitte zu einem bestimmten Zeitpunkt. Es bietet auch die Mittel für die gleichmäßige Behandlung aller Abschnitte über das Gehirn und sorgt für eine wissenschaftlich fundierte histologische Behandlung. Darüber hinaus bietet die Verwendung von eingebetteten Landmarken den zusätzlichen Vorteil, dass sie in der Lage, digital erwerben Färbungsmuster aus getrockneten und mit einem Deckglas gleitet und die digitalisierten Dateien in verschiedenen Formen des Motivs analysiert. Obwohl wir Beispiele von drei Antikörpern bereitzustellen, kann dieses Verfahren, um eine breite Palette von anderen Zielproteine sowie histologischen Färbungen, insbesondere jene, die Zytoarchitektur verschiedenen kortikalen Arealen zeigen und damit für die Zuordnung genutzt angewendet werden.
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Acknowledgments
Wir bedanken uns bei Frank Ervin, Roberta Palmour und das Personal des Behavioural Sciences Foundation Laboratories in St Kitts, West Indies, für ihre anhaltende Unterstützung unserer Primaten Arbeit befindet. Betriebskostenzuschüsse von der Canadian Institutes of Health Research (AC) und der National Engineering and Research Council of Canada (MP) - Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium Fragile X Research Foundation of Canada (FXRFC) auf SZ und unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-FMRP monoclonal antibody | Chemicon International | MAB2160 | Requires antigen retrieval in fixed tissue. |
| anti-NeuN monoclonal antibody | Chemicon International | MAB377 | N/A |
| anti-Neurofilament H monoclonal antibody | Sternberger Monoclonals Inc. | SMI32 | N/A |
| Antigen Unmasking Solution | Vector Laboratories | H-3300 | N/A |
| Normal horse serum | Invitrogen | 16050122 | 500 mL |
| Biotinylated Anti-Mouse IgG (H+L), made in horse | Vector Laboratories | BA-2000 | |
| VECTASTAIN ABC Kit (Standard) | Vector Laboratories | PK-4000 | 1.5 mg |
| Staining dish for floating sections | HistoTools | 10009 | 12 x 65 mm |
| Staining transport basket | HistoTools | 10012 | large (fits 12 x 65 mm dish) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | P8514B | N/A |
| DAB | Fisher Scientific | AC11209-0050 | N/A |
References
- Guide to the Care and Use of Experimental Animals. Olfert, E. D., Cross, B. M., McWilliam, A. A. , Canadian Council on Animal Care. Ottawa. (1993).
- Devys, D., Lutz, Y., Rouyer, N., Bellocq, J. P., Mandel, J. L. The FMR-1 protein is cytoplasmic, most abundant in neurons and appears normal in carriers of a fragile X premutation. Nat Genet. 4, 335-340 (1993).
- Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116, 201-211 (1992).
- Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proc Natl Acad Sci U S A. 80, 6126-6130 (1983).
