La preparación de bloques de células a partir de muestras de citología con predominio de células aisladas individualmente

Summary

Shidham método para la preparación de los bloques de celdas con AV-marcador de muestras de citología con células dispersas de forma individual y en pequeños grupos de células.

Abstract

Este vídeo demuestra Shidham método para la preparación de los bloques de celdas de líquidos muestras cervicovaginales citología de base que contiene las células de forma individual y en pequeños grupos dispersos de células. Esta técnica utiliza HistoGel (Thermo Scientific) con material de laboratorio convencionales.

El uso de secciones de bloque celular es una valiosa herramienta auxiliar para la evaluación de la no-citología ginecológica. Permiten que el citopatólogo para estudiar detalles adicionales muestra morfológicos incluyendo la arquitectura de la lesión. Lo más importante es que permiten la evaluación de los estudios complementarios como la inmunocitoquímica, ensayos in situ hibridación (FISH / CISH) e in situ la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Celulares tradicionales técnicas de preparación de bloques en su mayoría han sido aplicados a los no-muestras de citología ginecológica, por lo general por los derrames de líquido del cuerpo y las biopsias por aspiración con aguja fina.

Líquido muestras cervicovaginales base son relativamente menos móvil que los no-ginecológicos contrapartes con muchas células dispersas individuales. Debido a esto, la celularidad adecuada dentro de las secciones de bloque de celdas es difícil de lograr. Además, el histotecnólogo seccionar el bloque no puede visualizar el nivel en el que las células se encuentran en mayor concentración. Por lo tanto, es difícil controlar el nivel adecuado en las secciones que pueden ser seleccionados para ser transferidos a los portaobjetos de vidrio para la prueba. Como resultado, el área del bloque de celdas con las células de interés se pueden perder, ya sea mediante la reducción de pasado o no el corte lo suficientemente profundo. Protocolo actual para el método de Shidham aborda estos temas. Aunque este protocolo es estándar e informaron de muestras ginecológicas citología de base líquida, también se puede aplicar a las muestras no ginecológicas tales como fluidos derrame, FNA, cepillado, etc quiste contenidos para mejorar la calidad del material de diagnóstico en las secciones de bloque celular.

Protocol

Introducción:

Este es un video que describe el método para la preparación Shidham bloque de celdas de la citología de base líquida (LBC) muestra usando HistoGelTM (Thermo Scientific) (HG). En comparación con otros métodos de azar, las siguientes son las dos características fundamentales de este protocolo para la preparación de los bloques de celdas a partir de muestras relativamente hipocelular con células dispersas por separado perder (1-5).

1. Este protocolo incluye medidas para concentrar las células a lo largo del plano paralelo a la superficie de corte del bloque de celdas.
2. También incluye una inclusión faro como oscuro de AV-marcador (Figura 1b), que sirve a dos de los siguientes propósitos:
   1. Para visualizar el nivel en el que las células se concentran. El área del bloque de celdas con las células de su interés, puede ser visualizado por el histotecnólogo cuando la baliza de color oscuro se expone durante el corte. Esta capacidad de controlar contraseña para evitar el corte a través del nivel de la mayoría de las células, o de no cortar demasiado superficial en el nivel con mayor concentración de células de la muestra.
   2. Para servir como punto de referencia de localización en la sección de serie bloque de celdas en diferentes diapositivas. Este punto de referencia actúa como un faro para ayudar a localizar las células o grupos de células para la evaluación de un patrón de inmunorreactividad de coordinar con el enfoque de SCIP (6,7).

PROTOCOLO (Figura 2)

Preparación de la muestra.

1. Transferir el residuo LBC muestra de citología cervical a un tubo de vidrio plano inferior (15 mm de diámetro x 45 mm) (Figura 2.1 a 2.4). Coloque el tubo de vidrio en un tubo de plástico compañía más grande (28 x 85 mm) y se centrifuga. Retire el tubo de fondo de cristal del tubo portador y se vierte el sobrenadante.
2. El tubo de vidrio es el máximo (para evitar el derrame de agua de calefacción en el paso siguiente) y se coloca de nuevo dentro de un tubo grande de plástico de fondo plano portador
3. El tubo de plástico vehículo que contiene el tubo de vidrio es el máximo, coloca en una centrifugadora (con tazas giratorias y no tazas de ángulo fijo para que las células caen perpendicularmente a la parte inferior plana del tubo de vidrio), y se centrifugaron a 1.805 G (3000 rpm, rotor de radio-17cm) durante cinco minutos (Figura 2.5).
4. Los tubos se retiran de la centrífuga vertical y el tubo de cristal más pequeñas se retira con una pinza del tubo de plástico más grandes sin perturbar el precipitado sedimentado con las células.
5. El tubo de vidrio con la muestra es sin límite y el sobrenadante se vierte con cuidado de no perturbar la capa plana de células de sedimentos en la parte inferior (Figura 2.6).

La inclusión de la referencia de coordenadas AV-marcador y la adición de gel

1. Un faro oscuro AV-marcador (alrededor de 2 mm x 2 mm de tamaño, superficie plana, fragmento de material de color oscuro, sectionable) (Figura 3) se agrega como una señal para el tubo de vidrio (Figura 2.7).
2. Licuar una parte alícuota de HG por fusión en horno de microondas por 10 segundos a media potencia.
3. Añadir 0,5 ml de HG fundido en el tubo, se mezcla con los sedimentos con rapidez, y resumen (Figura 2.8) (Vaya al siguiente paso rápido sin permitir que el HG para comenzar a solidificar).
4. Añadir aproximadamente 2,5 ml de agua tibia (45 ° C) de agua al tubo de plástico portadora (Figura 2.9).
5. El tubo más pequeño de vidrio cubiertas se coloca dentro del tubo de plástico con agua tibia. (Este paso es necesario para mantener el HG se solidifique durante los próximos pasos) (Figura 2.9).
6. El tubo de plástico portadora se coloca en la centrífuga (con tazas giratorias y no tazas de ángulo fijo para que las células caen perpendicularmente a la parte inferior plana del tubo de vidrio), y se centrifugaron a 1.805 G (3000 rpm, radio-17cm rotor) durante cinco minutos. El propósito de esta etapa de centrifugación es empujar el marcador AV-y para concentrar las células en una capa más cercana a la superficie de corte del bloque de celdas de parafina último incorporado (Figura 1d).
7. Los tubos se retira con suavidad y vertical de la centrífuga cuidando de no alterar la capa de sedimento fino con las células de la muestra en la parte inferior.
8. El tubo de plástico más grande es no nivelado y el tubo de cristal más pequeñas se quita verticalmente con una pinza sin alterar la capa de sedimento de las células de la muestra.
9. El pequeño tubo de vidrio se refrigera en posición vertical durante 15 minutos para enfriar y solidificar el HG (Figura 2.11).

La eliminación del bloque de celdas como un botón de gel con muestras para su procesamiento final

1. El disco HG solidificado, con la capa de concentrado / sedimento muestra en el fondo se desprende de la parte inferior del tubo de vidrio plano por chorros de formol al 10% a través de una aguja de calibre 23 con la jeringa (Figura 2.12).
2. La aguja se introduce a lo largo del lado del tubo en la periferia del disco se solidificó con HG muestra (Figura 2.12).
3. El Needle se gira a lo largo del lado del tubo, mientras que la formalina es empujado lentamente a través de la jeringa. Esto resulta en la separación del botón junto con HG faro de color oscuro AV-marcador y la muestra se concentró en él desde el fondo plano del tubo de vidrio (Figura 2.12).
4. El bloque de celdas (botón de muestra de gel con las células) se coloca en una cinta de etiquetado y presentado para el procesamiento de tejidos embebidos en parafina para preparar los bloques de celdas (Figura 2.13).

Inclusión y corte de la muestra

1. El disco está incluido en parafina con el lado oscuro de radiobaliza hasta que la superficie de corte (Figura 1).
2. El bloque se secciona hasta que el color oscuro AV-marcador como un faro está expuesto y claramente visible.
3. De tres a cuatro secciones micras se cortan de este nivel que debe contener la mayor parte de las células individualmente dispersada por la muestra.
4. Las secciones se recogen en el portaobjetos para la tinción más, la tinción inmunohistoquímica, u otras pruebas, como se indica. Los protocolos para estos tests, incluyendo el tipo de diapositivas a utilizar para el montaje de las secciones puede variar. En general, para la inmunotinción, portaobjetos recubiertos se utilizan para evitar la pérdida de flotación y las secciones de las diapositivas durante las etapas de la inmunotinción.

Abreviaturas utilizadas (en orden alfabético): CISH, cromogénicos in-situ las pruebas de hibridación, el pescado, fluorescente in situ las pruebas de hibridación; FFPE, fijado en formol e incluido en parafina, FNA, aspiración con aguja fina; HG, HistoGel ™ (Thermo Scientific); LBC, la citología de base líquida, PCR reacción en cadena de la polimerasa;

Figura 1. La estructura del bloque de celdas preparadas por el protocolo de Shidham.

Figura 2. El resumen de los diferentes pasos para la preparación de bloque de celdas de muestra de LBC por el protocolo de Shidham.

Figura 3. Preparación de la AV-marcador de cáscaras de plátano.

Figura 4. Comparación de los bloques de celdas y secciones con y sin AV-marcador.

Figura 5. Comparación de la celularidad de las secciones del bloque de celdas con y sin AV-marcador.

Discussion

Bloques de celdas son una herramienta valiosa para la evaluación de muestras de citología varios (1). Lo más importante, además de los detalles arquitectónicos de la muestra, los bloques de celdas permiten la evaluación de los estudios complementarios como la inmunocitoquímica, fluorescente / cromogénico ensayos in situ hibridación (FISH / CISH) y PCR in situ. Una variedad de métodos para la preparación de bloque de celdas se describen. Sin embargo, la mayoría de estos son adecuados para no muestras de citología ginecológica, que contienen las células de un número relativamente elevado y con microfragmentos tejidos como en los aspirados FNA y algunos fluidos serosos, tales como derrames (1,3,4,5).

Debido a que los bloques de celdas principalmente proporcionar la oportunidad para la evaluación inmunocitoquímica, su tratamiento de preferencia debe ser similar a la de los fijado en formol e incluidos en parafina (FFPE) los tejidos. En última instancia, los resultados obtenidos después de la evaluación inmunocitoquímica de las secciones de bloque de celdas se comparan con los de la literatura publicada realiza principalmente en las secciones de tejido FFPE. Cualquier modificación en el protocolo potencialmente comprometer y anular la validez de los resultados obtenidos en los bloques de células procesan a través de distintos fijadores y las secuencias de otro reactivo que el utilizado para FFPE de rutina. Algunas de las técnicas comerciales pueden tener el inconveniente de procesamiento a través de un protocolo de exposición a otros fijador-reactivo de la exposición.

Varios métodos de preparación de células bloque están disponibles para los especímenes con una importante cantidad de sedimentos y fragmentos de tejido. Principalmente, los sedimentos concentrados son apoyados por un poco de gel o principio de la coagulación. El botón es fácil de manejar luego incluidos en parafina después del procesamiento, como las muestras de patología quirúrgica / biopsias.

Los geles utilizados son de gelatina, agar, el fibrinógeno / plasma trombina, y otros geles comerciales, tales como HG. Los métodos de concentración varían de granulación simple de los sedimentos por centrifugación a la concentración de células a lo largo de varios tipos de membranas. Los ejemplos incluyen: miliporo, collodin (celoidina) bolsas o raspar las células de los frotis de citología en portaobjetos de cristal (1). También se evaluó una variedad de geles, tratando diferentes combinaciones de agar y gelatina. Ninguna de las combinaciones de lograr la consistencia firme una suficiente para obtener un disco de fácil maniobrabilidad de gel solidificado con células incluidas en la muestra en una sola pieza. HG mostraron consistencia adecuada y en nuestra experiencia los resultados de inmunotinción en las secciones de HG bloque de celdas han sido excelentes.

Citología de base líquida (LBC) muestras para citología cervicovaginal y generalmente son menos móviles que los no-ginecológica especímenes como se mencionó anteriormente. Además, las muestras ginecológicas LBC contienen predominantemente individuales dispersas células exfoliadas superficial de la mucosa cervicovaginal. Debido a esto, la celularidad adecuada dentro de las secciones bloque de celdas no pueden lograrse sin un enfoque especial. A medida que estos individualmente dispersos componentes celulares en el bloque del no puede ser visto por el histotecnólogo durante el corte de la sección, el nivel en el que las células comienzan a aparecer en las secciones no se aprecia y puede perderse, ya sea mediante la reducción de más allá del nivel con la mayoría de las células o no corte bastante profundo en el nivel con mayor concentración de células de la muestra (Figura 4). Shidham protocolo de direcciones de estas dos cuestiones con HG como incrustación equipos de laboratorio y medio convencional (2) (Figura 2).

Este protocolo consiste en las dos siguientes características principales (Figura 1):

1. La concentración y la alineación de células dispersas por separado en un plano estrecho adyacente y paralela a la superficie de corte del bloque de celdas (Figura 5).
2. La inclusión de una baliza similar a oscuras AV-marcador como una señal. Esto es fundamental para el logro de las siguientes características:
   1. Identificación y seguimiento del nivel en el cual las células se concentran en el bloque de celdas. La exposición de la señal de color oscuro destaca el nivel en el que la mayoría de las células individualmente dispersos en el bloque de celdas se espera que se encuentra (Figura 4). Esto evita que la tala excesiva (más allá del nivel de corte con la mayoría de las células) o defecto (no corte bastante profundo en el nivel con mayor concentración de células de la muestra) en el bloque de celdas y permitir la selección de las secciones del nivel en el bloque de celdas correspondientes con mayor concentración de las células.
   2. La señal de color oscuro en las secciones también sirve como punto de referencia para estudiar y determinar exactamente las mismas células en diferentes secciones de serie del bloque de celdas en diferentes diapositivas (Figura 4). Esto es crítico, mientras que la interpretación y evaluación de las propiedades de coordinar immunoprofile como de las células en particular por el enfoque de SCIP a seguir las mismas células en las diferentes secciones (6,7).

Aunque our protocolo estandarizado e informó de las muestras de líquido basado en la citología cervical, también puede ser utilizado para mejorar el rendimiento diagnóstico de muchos otros no-ginecológica especímenes como los fluidos derrame, FNA, el cepillado, el contenido del quiste, etc Además, el marcador AV facilitaría la mejora aplicación del enfoque SCIP durante la evaluación inmunohistoquímica de secciones de bloque de celdas de estos ejemplares. El medio de inclusión podrán ser sustituidos por otros reactivos con las modificaciones apropiadas en los pasos pertinentes. HG podrá ser sustituido por plasma (fibrinógeno) para ser gelificada por la trombina a temperatura ambiente (1).