Biology

Bireysel Az hücreler baskın Sitoloji Numune Cell Block Hazırlama

Published: July 21, 2009 doi: 10.3791/1316

¹Department of Pathology, University of Wisconsin - Milwaukee

Summary

Tek tek dağılmış hücreleri ve küçük hücre grupları içeren sitolojisinde AV-işaretleyici ile hücre bloklarının hazırlanması için Shidham yöntemi.

Abstract

Bu video için Shidham tek tek dağılmış hücreleri ve küçük hücre grupları içeren sıvı bazlı servikovajinal sitolojisinde hücre bloklarının hazırlanması yöntemi göstermektedir. Bu teknik, geleneksel laboratuvar ekipmanları ile HistoGel (Thermo Scientific) kullanır.

Hücre blok bölümlerinin kullanımı, non-jinekolojik sitoloji değerlendirme için değerli bir yardımcı araçtır. Lezyonun mimarisi de dahil olmak üzere ek morfolojik örnek ayrıntılı çalışma sitopatolog sağlar. En önemlisi, in-situ hibridizasyon testleri (FISH / CISH) ve in-situ polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gibi immünsitokimya gibi yan çalışmaların değerlendirilmesi için izin verir. Geleneksel hücre blok hazırlama teknikleri, genellikle vücut sıvısı efüzyonlar ve ince iğne aspirasyon biyopsileri, çoğunlukla jinekolojik olmayan sitolojisinde uygulanır olmuştur.

Sıvı bazlı servikovajinal örneklerinde birçok bireysel dağınık hücreleri ile bunların non-jinekolojik bir muadillerine göre nispeten daha az hücresel. Bu nedenle, hücre blok kesimleri içinde yeterli hücresellik başarmak zordur. Buna ek olarak, blok kesit histotechnologist hücrelerin en yüksek konsantrasyon hangi düzeyde görselleştirmek. Bu nedenle, uygun seviyeye bölümlerde test için cam slaytlar aktarılacak seçilebilir hangi izlemek için zordur. Sonuç olarak, ya geçmişte kesme veya yeterince derin kesim tarafından ilgi hücreler ile hücre bloğu alanı, cevapsız olabilir. Shidham yöntemi için geçerli protokol, bu sorunları giderir. Bu protokol standart ve jinekolojik sıvı bazlı sitoloji örneklerinde için rapor olmasına rağmen, efüzyon sıvılar için hücre blok bölümlerde tanı malzeme kalitesi, ince iğne aspirasyon biyopsisi, manşonlarla, kist içeriği vb gibi Jinekolojik olmayan örneklerin de uygulanabilir olabilir.

Protocol

Giriş:

Bu HistoGelTM (Thermo Scientific) (HG) kullanarak sıvı bazlı sitoloji (LBC) örnek hücre blok hazırlanması için Shidham yöntemi anlatan bir video. Gibi rastgele diğer yaklaşımlara göre, bu protokolün iki kritik özellikleri tek tek dağılmış gevşek hücreleri (1-5) ile nispeten hiposellüler örneklerinden hücre bloklarının hazırlanması için.

Bu protokol, hücrelerin hücre blok kesme yüzeyine paralel düzlemi boyunca konsantre için gerekli adımları içerir.
Ayrıca, aşağıdaki amaçlarla iki hizmet AV-işaretleyici (Şekil 1b), bir deniz feneri gibi koyu dahil içerir:
1. Hücrelerin yoğunlaştığı hangi düzeyde görselleştirmek için. Koyu renkli işaret kesme sırasında maruz kaldığında ilgi hücreler ile hücre bloğu alanı histotechnologist tarafından görüntülendi olabilir. Bu yetenek izlemek için hücrelerin en düzeyi ile kesme ya da örnek hücrelerinin yüksek konsantrasyon seviyesine çok yüzeysel kesim önleyecektir.
2. Farklı slaytlar seri hücre blok bölümünde konumlandırıcı referans noktası olarak hizmet etmek. Bu referans noktası SCIP yaklaşım (6,7) ile bir koordinat immünoreaktivite desen değerlendirilmesi için hücrelerin özellikle hücre ya da gruplar bulmasına yardımcı olmak için bir işaret olarak görür.

PROTOKOL (Şekil 2)

Numunenin hazırlanması.

Düz bir alt cam tüp (15mm çap x 45mm) (Şekil 2.1 üzerinden 2.4) artık LBC servikal sitoloji örnek aktarın. Daha büyük bir plastik taşıyıcı tüp (28 x 85mm) ve santrifüj cam tüp içine yerleştirin. Taşıyıcı tüp cam altındaki tüp çıkarın ve süpernatantı dökün.
Cam tüp daha sonra kapatılmış (bir sonraki adımda ısıtma su dökülmesini önlemek için) ve daha büyük bir düz dipli taşıyıcı plastik tüp içine yerleştirilir
Cam tüp içeren taşıyıcı plastik tüp daha sonra, şapkalı bir santrifüj yerleştirilir (hücreler, düz cam tüp alt dik düşmek, böylece döner bardak ve sabit açılı bardak), ve 1805 G (3000 rpms döndü. rotor yarıçapı-17cm) beş dakika (Şekil 2.5).
Sonra santrifüj tüpleri dikey olarak kaldırılır ve küçük cam tüp hücreleri ile tortulaşmış pelet bozmadan daha büyük taşıyıcı plastik tüp forseps ile kaldırılır.
Numune ile cam tüp kapağını açıp ve süpernatantı tortu hücreler altta düz bir tabaka (Şekil 2.6) rahatsız etmemek için özen dökülür.

İçerme ve jel ek referans koordinat AV-işaretleyici

Karanlık bir işaret AV-işaretleyici (yaklaşık 2 mm X 2 mm boyutlarında, düz, koyu renkli, sectionable malzeme parçası, su yüzüne) (Şekil 3), cam tüp tabelasını (Şekil 2.7) eklenir.
10 saniye boyunca orta güçte mikrodalga eriterek HG bir kısım Liquefy.
0.5 ml erimiş HG hızlı bir tortu ile tüp karışımı ekleyin ve (HG katılaşabilme başlamak için izin vermeden hızlı bir şekilde bir sonraki adıma geçin) (Şekil 2.8) recap.
Yaklaşık 2.5 ml ılık (45 ° C) su taşıyıcı plastik tüp (Şekil 2.9).
Küçük kapaklı cam tüp ılık su ile plastik tüp içine yerleştirilir. (Bu adım, sonraki adımlarda katılaşabilme HG tutmak için gerekli) (Şekil 2.9).
Taşıyıcı plastik tüp santrifüj yerleştirilir (hücreler, düz cam tüp alt dik düşmek, böylece döner bardak ve sabit açılı bardak) ve beş 1805 G (3000 rpms, rotor yarıçapı-17cm) bükülmüş dakika. Bu santrifüj adımın amacı, AV-işaretleyici itmek ve son parafin hücre bloğu (Şekil 1d) kesim yüzeyi daha yakın bir tabaka haline hücrelerin konsantre.
Bu tüpler daha sonra, alt kısmında örnek hücreleri ile tortulaşmış ince bir tabaka rahatsız etmemek için özen santrifüj yavaşça ve dikey kaldırılır.
Büyük plastik boru kapağını açtı ve küçük cam tüp örnek hücrelerinin tortu tabakası bozmadan bir forseps ile dikey olarak kaldırılır.
Küçük bir cam tüp, dikey pozisyonda, serin ve HG (Şekil 2.11) katılaşmaya 15 dakika boyunca buzdolabında.

Son işlem için jel ile örnek bir düğme olarak hücre blok çıkarılması

Şırınga (Şekil 2.12) ile 23 gauge iğne ile% 10 formalin squirting tarafından, alt tortu / konsantre örnek tabakası ile katılaşmış HG disk, düz dipli cam tüp yerinden.
Örnek (Şekil 2.12) katılaşmış HG diskin çevresindeki tüpün kenarı boyunca iğne yerleştirilir.
Needlformalin şırınga yoluyla yavaş yavaş itilir e tüpün kenarı boyunca döndürülür. Bu sonuç, koyu renkli işaret AV-marker ve düz cam tüp altında (Şekil 2.12) konsantre numune ile birlikte HG düğmesine ayrılması.
Hücre bloğu (örnek hücreleri ile jel düğmesi) etiketli bir kaset yerleştirilir ve parafin hücre bloklarının (Şekil 2.13) hazırlamak için doku işleme için sunulur.

Gömülmesi ve numunenin kesme

Disk aşağı kesim yüzeyi gibi karanlık işaret işaretleyici tarafında (Şekil 1) parafine gömülü.
Bir işaret açık ve net bir şekilde görünür olduğu gibi blok koyu renkli AV-işaretleyici kadar kesitli.
Üç dört mikron bölümleri numune tek tek dağılmış hücreleri en içermelidir bu düzeyde kesilir.
Bölümler daha fazla boyama, immünhistokimyasal boyama ya da belirtildiği gibi diğer testler için cam slayt üzerinde toplanır. Bölümler montaj için kullanılacak slayt türü de dahil olmak üzere bu testleri için protokolleri farklılık gösterebilir. Genellikle immün kaplı slaytlar immün adımları sırasında kayan ve slaytlar bölümlerini kaybı önlemek için kullanılır.

(Alfabetik sırayla) kullanılan kısaltmalar: CISH, in-situ hibridizasyon testleri kromojenik; FISH, Floresan in situ hibridizasyon testleri; FFPE, formalin ile fikse parafine gömülmüş; ince iğne aspirasyon biyopsisi, ince iğne aspirasyon, HG, HistoGel ™ (Thermo Scientific); LBC, sıvı bazlı sitoloji; PCR Polimeraz zincir reaksiyonu;

Şekil 1. hücre blok yapı Shidham protokol tarafından hazırlanmış.

Şekil 2 Shidham protokol LBC örnek hücre blok hazırlamak için farklı adımlar özeti.

Şekil 3 muz soyma AV-marker hazırlanması.

Şekil 4 ve AV-işaretleyici ve bölümlerin hücre bloklarının karşılaştırılması.

Şekil 5 AV-damgalı olan ve olmayan hücre blok bölümleri hücresellik karşılaştırılması.

Discussion

Hücre blokları çeşitli sitolojisinde (1) değerlendirilmesi için değerli bir araç. En önemlisi, örnek mimari detaylara ek olarak, hücre bloklarının gibi immünsitokimya gibi yardımcı çalışmalar, kromojenik / floresan in-situ hibridizasyon testleri (FISH / CISH) ve in-situ PCR değerlendirilmesi için izin verir. Hücre blok hazırlanması için çeşitli yöntemler açıklanmıştır. Ancak, bunların çoğu nispeten birçok hücreleri içeren ve doku FNA aspiratlarda gibi microfragments ve seröz efüzyonlar (1,3,4,5) gibi bazı sıvılar ile non-jinekolojik sitoloji örnekleri için uygundur.

Hücre bloklarının öncelikle immünositokimyasal değerlendirilmesi için bir fırsat sağladığı için, onların işleme tercihen formalin ile fikse parafine gömülü (FFPE) dokuları ile benzer olmalıdır. Sonuçta hücre blok bölümden immünositokimyasal değerlendirmesinden sonra elde edilen sonuçlar bu FFPE doku kesitlerinde ağırlıklı yayınlanan literatür ile karşılaştırıldı. Protokol herhangi bir değişikliğin potansiyel uzlaşma ve farklı fiksatif ve diğer rutin FFPE için kullanılan daha reaktif dizileri ile işlenmiş hücre bloklarının elde edilen sonuçların geçerliliğini geçersiz. Bazı ticari teknikleri, diğer fiksatif-reaktif maruz maruz kalma bir protokol ile işleme dezavantajı olabilir.

Hücre blok hazırlanması, tortu ve doku parçaları önemli bir miktarı ile örnekler için çeşitli yöntemler mevcuttur. Prensip olarak, konsantre sedimanlar bazı jel veya pıhtılaşma prensibi tarafından desteklenmektedir. Manevra düğmesine sonra cerrahi patoloji örneklerinde / biyopsileri gibi işlendikten sonra parafine gömüldü.

Kullanılan jeller, jelatin, agar, fibrinojen / plazma trombin ve diğer ticari jeller gibi HG içerir. Konsantrasyon yöntemleri, çeşitli tipte membran boyunca hücreler santrifüj tarafından tortu basit peletleme konsantrasyonu değişir. Örnekler şunlardır: Milipore, collodin (Celloidin) torba veya cam slayt (1) sitoloji smear hücreleri kazıma. Ayrıca jeller agar ve jelatin farklı kombinasyonları deneyerek çeşitli değerlendirildi. Kombinasyonların hiçbiri, katılaşmış jel kolayca manevra diski tek parça halinde numune gömülü hücreler elde etmek için bir firma yeterince tutarlılık elde etti. HG uygun tutarlılık gösterdi ve tecrübemizi HG hücre blok bölümlerde immün sonuç mükemmel olmuştur.

Yukarıda da belirtildiği gibi servikovajinal sitoloji için Sıvı bazlı sitoloji (LBC) örnekleri Jinekolojik olmayan örneklerin daha az hücresel. Jinekolojik LBC örneklerin yanı sıra, ağırlıklı olarak bireysel servikovajinal mukoza dağınık eksfolyatif yüzeysel hücreler içeriyor. Bu nedenle, hücre bloğu bölümleri içinde uygun hücresellik özel bir yaklaşım olmadan elde edilebilir. Bu tek başına blok hücresel bileşenleri dağınık olarak bölüm kesim sırasında histotechnologist görülen olması değil. Hücrelerin bölümlerde görünen başlatmak hangi düzeyi ya çoğu hücremizde düzeyini geçmiş kesim tarafından ya da değil, takdir olarak değil edebilir ve atlanabilir örnek hücreleri (Şekil 4) ile en yüksek konsantrasyon seviyesine yeterince derin kesme. Shidham protokol HG, orta ve geleneksel laboratuvar ekipmanları (2) (Şekil 2) gömme olarak kullanarak bu konuların her iki adres.

Bu protokol, iki önemli özellikleri (Şekil 1) Aşağıdaki içerir:

Konsantrasyon ve hücre bloğu (Şekil 5) kesim yüzeyine paralel ve bitişik dar bir düzlemde tek tek dağılmış hücreleri uyum.
Tabelasını olarak bir deniz feneri gibi koyu AV-işaretleyici dahil edilmesi. Bu aşağıdaki özelliklere ulaşmak için kritik öneme sahiptir:
1. Belirlenmesi ve hücreleri hücre blokta yoğunlaştığı hangi düzeyde izlenmesi koyu renkli tabelasını hücre bloğu içinde tek tek dağılmış hücreleri (Şekil 4) yer olması bekleniyor hangi maruziyet düzeyi vurgulamaktadır. Engeller (seviye geçmiş en hücreleri ile kesme) veya hücre bloğu kırarak (örnek hücrelerinin yüksek konsantrasyon seviyesine yeterince derin kesme) ve en yüksek konsantrasyon ile ilgili hücre bloğunda seviyesinden bölümlerin seçimine izin kesmesini hücre.
2. Bölümlerde koyu renkli tabelasını da aynı hücrelerden farklı slaytlar hücre bloğu (Şekil 4) farklı seri bölümlerde araştırma ve tanımlamak için bir referans noktası olarak hizmet vermektedir. Yorumlanması ve SCIP yaklaşımı özellikle hücrelerin immunoprofile aynı hücrelerin farklı bölümler (6,7) takip koordinat özelliklerini değerlendirirken Bu kritik.

Rağmen our protokolü standardize edilmiş ve sıvı bazlı servikal sitoloji örnekleri için bildirilen, aynı zamanda efüzyon sıvılar, ince iğne aspirasyon biyopsisi, manşonlarla, kist içeriği vs gibi diğer birçok Jinekolojik olmayan örneklerin yanı sıra tanısal verimi artırmak için kullanılan olabilir AV marker geliştirilmiş kolaylaştırmak Bu örneklerin hücre blok bölümden immünohistokimyasal değerlendirme sırasında SCIP yaklaşım uygulama. Gömme orta ilgili adımları uygun değişiklikleri ile diğer reaktifler tarafından değiştirilebilir. HG, oda sıcaklığında (1) Trombin tarafından jel plazma (Fibrinojen) tarafından değiştirilebilir.

Acknowledgments

Yazarlar AV kalemi ile hücre blok kesme bölümünde gösteren Chris Chartrand, HT (ASCP) teşekkür ederim.

References

Shidham, V. B., Epple, J. Chapter 14, Appendix I: Collection and processing of effusion fluids for cytopathologic evaluation. Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. Shidham, V. B., Atkinson, B. F. , Elsevier. Forthcoming.
Varsegi, G., D'Amore, K., Shidham, V. p16INK4a Immunocytochemistry as an Adjunct to Cervical Cytology - Potential Reflex Testing on Specially Prepared Cellblocks from Residual Liquid Based Cytology (LBC) Specimens. Modern Pathology 22: 98th Annual Meeting of United States and Canadian Academy of Pathology. 2009 Mar 7-13, Boston, Ma, , Abstract 424 97a-97a (2009).
Nigro, K., Tynski, Z., Wasman, J., Abdul-Karim, F., Wang, N. Comparison of cell block preparation methods for nongynecologic ThinPrep specimens. Diagn Cytopathol. 35, 640-643 (2007).
Saleh, H. A., Hammoud, J., Zakaria, R., Khan, A. Z. Comparison of Thin-Prep and cell block preparation for the evaluation of Thyroid epithelial lesions on fine needle aspiration biopsy. CytoJournal. 5, 3-3 (2008).
Kyroudi, A., Paefthimiou, M., Symiakaki, H., Mentzelopoulou, P., Voulgaris, Z., Karakitsos, P. Increasing diagnostic accuracy with a cell block preparation from thin-layer endometrial cytology: a feasibility study. Acta Cytol. 50, 63-69 (2006).
Atkinson, B. F. Chapter 5: Immunocytochemistry of effusion fluids: introduction to SCIP approach (Chapter 5. Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. Shidham, V. B., Atkinson, B. F. , Elsevier. (2007).
Shidham, V. B. Chapter 15, Appendix II: Immunocytochemistry of effusions processing and commonly used immunomarkers. Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. Shidham, V. B., Atkinson, B. F. , Elsevier. (2007).