Summary
دليل خطوة بخطوة لتوليد اجنة استهدفت الزرد خيالية بواسطة زرع في المرحلة الأريمة أو المعيدة.
Abstract
واحدة من أقوى الأدوات المستخدمة لاكتساب المعرفة في العمليات التنموية المعقدة هو تحليل للأجنة خيالية. يتم تعريف كائن خرافي كما يحتوي على خلايا من اكثر من حيوان واحد ؛ الفسيفساء هي نوع واحد من الوهم تمتزج فيه خلايا من اكثر من التركيب الوراثي ، وعادة من النوع البري ومتحولة. في الزرد ، ويمكن بسهولة جعل الوهم زرع خلايا من الجنين المانحة الى الجنين المضيف في المرحلة الجنينية المناسبة. يتم إنشاء خلايا المسمى المانحة عن طريق الحقن من علامة النسب ، مثل صبغة الفلورسنت ، في مرحلة الجنين واحد الخلية. تتم إزالة الخلايا من الأجنة المانحة المسمى المانحة والمضيفة التي أدخلت أجنة غير المسماة باستخدام النفط التي تسيطر عليها ماصة الزجاج التي شنت على مجمع أو مجهر تشريح. يمكن في بعض الحالات تكون الخلايا المانحة التي تستهدف منطقة محددة أو أنسجة النامية الأريمة أو المعيدة مرحلة الجنين المضيف عن طريق اختيار موقع الزرع في الجنين المضيف على أساس خرائط مصير راسخة.
Protocol
دليل خطوة بخطوة لتوليد اجنة استهدفت الزرد خيالية بواسطة زرع في المرحلة الأريمة أو المعيدة.
واحدة من أقوى الأدوات المستخدمة لاكتساب المعرفة في العمليات التنموية المعقدة هو تحليل للأجنة خيالية. يتم تعريف كائن خرافي كما يحتوي على خلايا من اكثر من حيوان واحد ؛ الفسيفساء هي نوع واحد من الوهم تمتزج فيه خلايا من اكثر من التركيب الوراثي ، وعادة من النوع البري ومتحولة. في الزرد ، ويمكن بسهولة جعل الوهم زرع خلايا من الجنين المانحة الى الجنين المضيف في المرحلة الجنينية المناسبة. يتم إنشاء خلايا المسمى المانحة عن طريق الحقن من علامة النسب ، مثل صبغة الفلورسنت ، في مرحلة الجنين واحد الخلية. تتم إزالة الخلايا من الأجنة المانحة المسمى المانحة والمضيفة التي أدخلت أجنة غير المسماة باستخدام النفط التي تسيطر عليها ماصة الزجاج التي شنت على مجمع أو مجهر تشريح. يمكن في بعض الحالات تكون الخلايا المانحة التي تستهدف منطقة محددة أو أنسجة النامية الأريمة أو المعيدة مرحلة الجنين المضيف عن طريق اختيار موقع الزرع في الجنين المضيف على أساس خرائط مصير راسخة.
الجزء 1 : عن طريق الحقن اسماك الزرد الأجنة في مرحلة 1 - الخلية.
- الأنزيمية dechorionation الأجنة المرحلة 1 - الخلية.
إلى الأجنة dechorionate proteolytically ، في احتضان المرحلة 1 خلية ل ~ 1-5 'في محلول 0.5 pronase ملغ / مل كما هو موضح في كتاب اسماك الزرد 1. Moniter dechorionation عن كثب ، ويغرق في الأجنة متوسطة الأجنة (EM) مع القلم / 1 بكتيريا حالما تبدأ chorions للانهيار واضح. فور الافراج عنه من chorions بهم والأجنة مرحلة الأريمة والمعيدة هشة وستتمسك البلاستيك أو تتفكك إذا تعرضت للهواء. بالتالي إبقاء الأجنة dechorionated الغارقة في القلم / EM بكتيريا ، ونقل بين أطباق النار باستخدام مصقول واسعة تحمل الماصة الزجاج ، والمحافظة في أي الصحون البلاستيكية المغلفة آغار (1.2 ٪ في agarose القلم / EM بكتيريا) أو تعقيمها أطباق بتري الزجاج. - حقن الأجنة dechorionated مع علامة النسب.
إعداد طبق حقن عن طريق إدراج شريحة زجاجية بزاوية 45 درجة في جميع أنحاء أوسع جزء من طبق بيتري ثلاثة أرباع الكامل 1.2 ٪ agarose المحرز في القلم / EM بكتيريا. إزالة الشريحة بعد التصلب agarose يترك حوض مشطوف. نقل الأجنة dechorionated في الحضيض من طبق حقن مليئة القلم / EM بكتيريا. ضخ كميات من علامة 1nl نسب محسوبة بدقة باستخدام النار وانسحبت الزجاج ماصة الحقن وتلاعب ضغط الحقن ، كما هو موضح في كتاب اسماك الزرد 1. حقن الأصباغ وانخفاض نسب استشفاف الوزن الجزيئي مباشرة في صفار الأجنة dechorionated بين 1 -- و 4 خلايا مراحل. حل 3 ٪ من ديكستران الفلورسنت يكفي للسماح للكشف عن الخلايا المشتقة من المانحين في أجنة خيالية من خلال عدة ايام من التنمية. عندما علامة النسب هو مرنا ترميز بروتين فلوري (لGFP ، أو مثيل RFP) ، وضخ مباشرة في خلية من خلايا المبكر 1 الجنين المرحلة. - الحقن غير dechorionated الأجنة مع علامة النسب.
إعداد أطباق الحقن المتعدد بشكل جيد من قبل ترسيخ agarose 1.2 ٪ في EM حول العفن مع الآبار تقريبا نفس عرض قطرها المشيماء. عدم نقل الأجنة في dechorionated طبق حقن متعددة جيدا نصف مليئة القلم / EM بكتيريا. إزالة السوائل الزائدة. يجمد بالتالي ، يمكن حقن الأجنة مع وحدات التخزين 1nl من علامة النسب على النحو المبين أعلاه. - رفع حقن الأجنة للزرع.
رفع أجنة في كثافة منخفضة (40-50 الأجنة في الطبق) في القلم طازجة / EM بكتيريا. مباريات مرحلة الأجنة المانحة والمضيفة للزرع تستخدم بشكل وثيق إلى حد ما. لزرع الدرع المرحلة ، وتهدف للمانحين لتأخر قليلا خلف المضيفين ، علما أن الأجنة حقن تميل الى ان تكون تأخرت قليلا. احتضان أجنة في درجات حرارة مختلفة ، و 25 درجة مئوية و 28 درجة مئوية و 31 درجة مئوية ، لارباك تنميتها وتعظيم النافذة الزمنية التي يمكن أن يؤديها زرع.
الجزء 2 : جعل الأجنة الزرد خيالية بواسطة الزرع.
- زرع في المراحل الأريمة على stereomicroscope
- وصف للتلاعب لزرع الأريمة
جهاز يستخدم لزرع الخلايا في الأريمة الزرد يتكون من حقنة ميكرومتر هاميلتون يسيطر محرك (10 L - 50 L) المرفق بواسطة محبس ثلاثي إلى خزان للنفط والمعادن إلى حائز micropipette من خلال أنابيب يبلغ طوله مرنة . بعد تجميع الحفار الزرع ، ويتم تعبئة مع الزيوت المعدنية ، مع الحرص على إزالة جميع فقاعات الهواء من النظام. سيكون وجود فقاعة الهواء يؤثر سلبا على قدرتك على السيطرة اله شفط والضغط. استخدام stereomicroscope مع التكبير عالية نوعا ما جيد والبصريات (التكبير 80x مثالي على الأقل). يمكن التحكم في الموضع صاحب micropipette وإبرة من قبل micromanipulator دليل Narishige ، أما الحقن ، ولكن ، إذا كانت قاعدة المجسام واسع جدا للسماح بالوصول السهل مع micromanipulator ، ثم محول التي يعلقها على جثة ويمكن أيضا أن يكون شراؤها من stereomicroscope Narishige. يجب أن المتصاعدة من micromanipulator يكون مستقرا للغاية من أجل تجنب نقل الاهتزازات إلى الإبرة زرع الأعضاء ؛ قاعدة المغناطيسي يعمل بشكل جيد لهذا الغرض. - إعداد ماصة زرع
مصنوعة من زرع الإبر الماصات الزجاج الشعرية (انظر خيارين في الجدول أدناه الكواشف) التي يتم رسمها لطيف تفتق على مجتذب الكهربائي. كسر غيض من خارج إبرة تحت المجهر تشريح razorblade باستخدام حافة مستقيمة في نقطة حيث القطر الداخلي للإبرة أكبر قليلا من أن زرع الخلايا. عقد razorblade بزاوية ضئيلة لإنشاء شطبة وجعل كسر بأكبر قدر من السلاسة ، مع عدم وجود حواف خشنة. لزرع المرحلة الأريمة ينبغي القطر الخارجي للإبرة تدبير ما يقرب من 50-60 ملم. - تصاعد الأجنة لزرعها في قوالب آغار
إعداد أطباق الحقن التي تطفو في قالب من البلاستيك مع صفوف من نتوءات على شكل وتد في طبق بيتري أن نصف مليئة المنصهر agarose 1.2 ٪ في EM. مرة واحدة وقد عززت agarose ، إزالة القالب ، وترك أمر آغار العفن الذي يحتوي على صفوف من الآبار triangularly كل شكل كبير بما يكفي لاجراء جنين واحد. ملء القالب زرع مع القلم / EM بكتيريا وتحميل الأجنة مرحلة الأريمة فردي في كل جيدا مع الزجاج المصقول ماصة النار بحيث توضع الأجنة المانحة أسفل عمود واحد وتوضع الأجنة المضيفة أسفل العمود المجاور. - زرع الخلايا
الأجنة الموقف في الآبار زرع على جنوبهم ؛ موضعها مع ماصة حسب الحاجة خلال زرع الزرع ، مع الحرص على عدم ثقب صفار. موقف طبق على المسرح بحيث انه عندما يدخل إبرة زرع الجنين ، يدفع الإبرة الجنين ضد الجدار الخلفي جيدا لها. باستخدام micromanipulator ، وانخفاض الإبرة زرع في الطبق بزاوية حادة جدا. مثالي ينبغي إدخال الإبرة زرع الجنين في زاوية ما يقرب من 45 درجة. مرة واحدة في رأس الإبرة هو تحت سطح المتوسط الجنين ، واستخلاص كمية صغيرة من متوسطة إلى الجنين عن طريق إبرة التواء محرك ميكرومتر السيطرة على حقنة هاملتون. للتحكم أكثر دقة ، ينبغي أن التفاعل بين الزيوت المعدنية والمتوسطة الجنين تبقى في جزء منه ، رقيقة مدبب من الإبرة ، ولكن ليست قريبة جدا لهذه الغاية. موقف بلطف الجنين المانحة مع الإبرة ثم سحب الإبرة مرة أخرى وأدخل غطاء الأريمة الجنين في الموضع المطلوب. سوف سريع وتضررت بشدة اختراق الجنين دون الامر الذي ادى الى لفة. وضع الخلايا المانحة ببطء وبعناية في الإبرة. إذا أخذت الخلايا بسرعة جدا ، فمن المرجح أن القص. أيضا تجنب اتخاذ صفار يصل الى الإبرة ، كما أنه سيتم ربط الزيوت المعدنية ، والتي سوف تقتل ثم الخلايا. بعد أخذ العدد المطلوب من الخلايا يصل ، عكس الضغط قليلا لوقف الشفط وإزالة الإبرة من الجنين. جعل الجنين المضيف في موقف للنقل طبق الزرع. ويمكن إجراء تعديلات صغيرة لموقف الجنين المضيف عن طريق تحويل برفق باستخدام إبرة الزرع ، طالما هو الحرص على عدم لمس صفار. عندما طرد الخلايا المانحة في الجنين المضيف ، وتجنب ادخال كمية كبيرة من الأجنة المتوسطة أو أي زيت معدني ، وهذا يمكن أن تتداخل مع التنمية أو قتل الجنين. الموقف من الخلايا على طول محور الحيوانية النباتية التأثيرات مساهمتها في واحد من الطبقات الجرثومية الثلاث ، الأديم الباطن ، الأديم المتوسط ، والأديم الظاهر 2،3. تبعا لذلك ، فإن الخلايا التي تم زرعها بالقرب من الهامش قبل بداية تكون المعيدة تثير تفضيلي لالأديم الباطن والأديم المتوسط ، في حين أن الخلايا التي تم زرعها في اتجاه القطب الحيواني ستسهم في مصائر الأدمة ، والأكثر شيوعا الأديم الظاهر سطح الدماغ المقدم والعينين. ومن ثم لا يمكن أن يتحقق قدر من استهداف الأنسجة حتى في مراحل الأريمة. بعد أن تم الانتهاء من عمليات نقل الخلايا ، ونقل أزواج الجهات المانحة والمضيفة للأجار الآبار المغلفة من 24 لوحة جيدا لمواصلة تطوير.
- زرع في المراحل المعيدة في مجمع المجهر
- وصف للتلاعب زرع
نقل الخلية التي أجريت على مركب من الاستفادة مجهر مراقبة دقيقة للموقف إبرة يوفرها النفط ثلاثة محاور هيدروليكيةmicromanipulator. هذا micromanipulator تسيطر على الحركات الدقيقة للزرع ماصة ، بينما يتم التحكم في شفط ماصة بواسطة حقنة هاميلتون ميكرون حملة مماثلة لتلك المستخدمة في عمليات زرع الأريمة. مجهر مركب تستقيم مع مرحلة الثابت هو الأفضل لأداء التحويلات تركز هذه الخلية منذ المجهر لا يؤدي إلى نقل الجنين بالنسبة للماصة. ومع ذلك ، إذا يجب استخدام مجهر مركب قابل للتعديل المرحلة ، يمكن بعد ذلك شنت micromanipulator إلى مرحلة بدلا من جسم المجهر مع نفس التأثير. مهايئات التي توفر خيارات لتركيب micromanipulator إما إلى المرحلة أو هيئة من المجاهر المركبة من مجموعة متنوعة من الشركات وتتوفر أيضا من Narishige. - إعداد ماصة زرع
زرع الإبر مصنوعة أساسا كما هو موضح أعلاه ، على زرع مرحلة المعيدة فتحة الإبرة المثالي هو ملم 30-40. بعد تشكيل درع ، وطبقة التغليف (EVL) يصبح أكثر الناس التزاما ، مما يجعل من الصعب على لاختراق الإبرة زرع الجنين. لتسهيل إدخال إبرة ، سحب شوكة في نهاية الإبرة باستخدام microforge. أولا ، على نحو سلس غيض من الإبرة التي جعلها قريبة من خيوط من microforge ؛ بدوره ثم الإبرة بحيث الحافة الأمامية للشطبة يمكن اجراء اتصالات مع خيوط. مرة واحدة على حافة الرائدة في مجال الاتصالات وخيوط إبرة ، تسحبه بعيدا بسرعة لخلق الشائكة ، أو الحربة. لتجنب الخلايا الضارة ، وينبغي أن يكون شوكة على التوالي وغيض من الإبرة لا ينبغي أن منحنى - تصاعد الأجنة لزرعها في methylcellulose
لزرع المجهر المركب ، جبل الأجنة على شريحة الاكتئاب في محلول 3 ٪ من methylcellulose (سيغما) المنحل في وسط جنين. أولا ، مسحة شريط عمودي methylcellulose في الاكتئاب من الزجاج الشريحة الاكتئاب ، ثم الفيضانات مع كمية سخية من المتوسط الجنين. باستخدام الماصة النار مصقول ، ونقل أحد المانحين وثلاثة تستضيف الدرع المرحلة تحت سطح EM على الشريحة الاكتئاب على جانب واحد من methylcellulose. اختيار الأجنة المانحة التي هي أصغر قليلا من المضيفين (30-50 ٪ اكتفار). مع حلقة صغيرة مصنوعة من قبل الإلتصاق نهايات طول القصير من 2 رطل خط الصيد الاختبار في نهاية الأنبوب الشعري ، ولفة بلطف الأجنة المانحة والمضيفة حتى على الجزء العلوي من الشريط methylcellulose وأشياء عليهم في methylcellulose حتى آمنة. إذا كانت الخلايا المزروعة أن تكون موجهة لمعرفة وجه الخصوص ، المجال للمرحلة مصير الدرع خريطة 3،4 والموقف من النسيج المستهدف النسبي للدرع ضروري بحيث يمكن وضع الأجنة المضيفة بشكل صحيح. كما توضع الأجنة في methylcellulose المضيف ، ولفة لهم في موقف بحيث أن المنطقة المستهدفة هي العلوي ، منذ زرع خلال الإبرة يدخل الجنين بشكل طفيف لتسليم الخلايا المانحة دون الإضرار صفار. - زرع الخلايا
موقف إبرة زرع بنقلها الى المستوى البؤري للجنين. الأولى تركز على الجنين المانحة باستخدام الهدف 10X. ثم نقل الجنين جانبية ، ودون تعديل البؤري ، واستخدام عناصر التحكم من micromanipulator لجلب رأس الإبرة زرع في التركيز. موقف صاحب micropipette والإبرة بزاوية ضحلة نسبيا ، بحيث الإبرة هو أقرب إلى أفقي كما حافة الاكتئاب على الشريحة سيسمح. إذا شنت الجنين بشكل صحيح في methylcellulose ، فإنه لن لفة كما يدخل إبرة زرع ، ما لم يكن الجنين قديم جدا للسماح لاختراق الإبرة بسهولة. طبقة التغليف ويبدو أن تشديد في سن الأجنة ، لذلك ، يتم تنفيذ عمليات زرع أفضل مرحلة المعيدة اليمين بعد تشكيل الدرع. بعد مرحلة القبة ، وصفار يتواجد فقط تحت غطاء خلايا الأريمة ، الذي يخفف تدريجيا مع عائدات اكتفار. من أجل تجنب اختراق صفار ، ينبغي إدخال الإبرة الجنين في الطائرة التي يتم التركيز فقط أعمق قليلا من ذلك من EVL. عند إزالة أعداد كبيرة من خلايا من الجنين المانحة ، وتحريك الإبرة حول ما يتم أخذ الخلايا الأعلى ، من أجل تجنب قصد امتصاص الصفار في الإبرة. إذا الخلايا من الأجنة المانحة واحدة هي أن يكون زرع المضيفين متعددة ، فمن الأفضل أن تدخل الجهات المانحة مع الإبرة مرة واحدة فقط من أجل تقليل احتمال وقوع أضرار. ويمكن عندئذ الخلايا المانحة نقلها إلى الموقع المطلوب في استضافة ما يصل إلى الأجنة الثلاثة. عند نقل الخلايا من الأجنة المانحة اثنين أو أكثر من جنين في استضافة واحد ، فمن الأفضل أن تأخذ الخلايا من الأجنة كل من الجهات المانحة في إبرة الزرع نفسه قبل زرعها في جنين المضيف. هذا يقلل من الأضرار التي لحقت الجنين المضيف ، ويضمن أن يتم نقل الخلايا إلى نفس المنطقة من الجنين ، بحيث يمكن مقارنة تصرفاتهم. القليل جدا خلط OCالأوغاد بين الخلايا المانحة داخل إبرة الزرع ، ولذلك ، ينبغي نقل الخلايا إلى مضيف واحد عندما يتم استخدام أكثر من الجهات المانحة. من أجل زيادة احتمال أن الخلايا المانحة ستساهم في النسيج المطلوب ، وطرد الخلايا المانحة بينما يتم رسمها من خلال إبرة في المنطقة المستهدفة ، في مقابل إيداع الخلايا في أجمة واحد. حالما يتم الانتهاء من نقل الخلية ، ضع الشريحة بأكملها في طبق بتري والوقاية من الفيضانات بعناية مع القلم / EM بكتيريا. خلال الساعات القليلة القادمة سوف methylcellulose حل ، والإفراج عن الأجنة.
الشكل 1 : مجهر انشاء لصنع أجنة خيالية. ج : زرع مجهر تشريح تلاعب يتكون من النفط حقنة مليئة هاميلتون مع محرك ميكرومتر (أ) متصلة خزان مملؤة بالنفط (ب) وزرع ماصة (ج) من خلال محبس 3 الطريقة (د). هي التي شنت على زرع ماصة micromanipulator الخشنة (ه) وهو يعلق على صفيحة معدنية قاعدة (لا يظهر) عن طريق القدم المغناطيسي (و). يتم إجراء عمليات زرع في مرحلة من مراحل stereomicroscope (ز) أن تكون مجهزة الإضاءة السفلية للبصريات الأمثل. باء : عملية زرع المجهر تلاعب مجمع يتألف من محرك مملؤة بالنفط وحقنة هاميلتون ميكرومتر مماثلة (أ ، ب) ولكن في هذه الحالة هي التي شنت على زرع ماصة حامل ماصة (ج) الذي X ، Y Z والحركات يمكن السيطرة عليها إما عن طريق micromanipulator (ه) الخشنة (د) أو الغرامة. في هذا المثال ، يتم تحميل micromanipulator على جسم المجهر الثابتة المرحلة ، ومع ذلك فإنه من الممكن أيضا أن يشن على مرحلة المجهر العادية. وتصور الأجنة ، والتي هي وظائفها في methylcellulose على شريحة الاكتئاب ، وذلك باستخدام الهدف 10X (و). C : العفن لزرع الأجنة لزرع شل حركة stereomicroscope. يتم إسقاط الأجنة Dechorionated فردي داخل الآبار التي صب في هذا القالب agarose في طبق بتري ضربات 90mm. وتظهر أبعاد الآبار.
الشكل 2 : تركيب المعيدة الأجنة لمرحلة الزرع. ج : الشكل المثالي لزرع المعيدة ماصة. وشطبة مع طرف حاد يساعد في اختراق الجنين. باء : الشل المانحة والمضيفة في methylcellulose الأجنة. وضعت هناك قطاع من methylcellulose باستمرار في البئر شريحة الاكتئاب وغمرت المياه مع كمية سخية من المتوسط الجنين. تضاف إلى الأجنة المتوسطة الجنين وتدحرجت على وmethylcellulose به حلقة صغيرة (C). المديرية العامة للتضخم الأجنة في الشكل. 1B. D : الجنين المانحة موجه للسماح أسهل في الوصول للماصة ، لأن الخلايا غير ملتزم بها لا تزال في هذه المرحلة. الدرع موجهة مرحلة الأجنة المضيفة حتى يمكن للمنطقة المستهدفة هي العلوي : على سبيل المثال. والخلايا التي تم زرعها في المناطق محاصر تسهم في الدماغ المؤخر الظهرية وقمة الجمجمة العصبية المشتقة من الجهة اليسرى (E) واليمين الجانبين (G) أو إلى الدماغ المؤخر بطني والحبل الشوكي (F).
الشكل 3 : صور الممثل للأجنة خيالية.
(AC) أجنة خيالية 18hpf التي تم إنشاؤها بواسطة زرع في هذه المرحلة هو مبين في عرض الدرع الظهري ، الأمامي إلى اليسار. (أ ، ب) الفرز وظائف للمستقبلات سطح الخلية التي كشفت عنها EphA4 تحليل الأجنة خيالية. لوحات اليسار : دمج الخلايا التي تحمل علامات رودامين المانحة (rhod.) (الحمراء) ، وأعرب عن GFP المعدلة وراثيا في قطاعات محددة الدماغ المؤخر (الخضراء). (A) خلايا WT المساهمة في الدماغ المؤخر الكاملة لمراقبة الجنين خيالية. (ب) يتم استبعاد الخلايا المانحة EphA4 - المنضب من قطاعات معينة في الدماغ المؤخر مضيف WT. (ج) الخلايا المانحة التي تستهدف أجزاء مختلفة من الأنبوب العصبي في مرحلة زرع الدرع المضاد للصواريخ. الخلايا المانحة (الحمراء) تستهدف الدماغ المقدم / الدماغ المتوسط (اللوحة اليسرى) أو الدماغ المؤخر / الحبل الشوكي (اللوحة اليمنى) لاستضافة WT مكافحة ملطخة جسم EfnB2a أن يصادف الدماغ الأمامي ، والحدود في منتصف الدماغ المؤخر والجزء الأوسط من الدماغ المؤخر (الخضراء). أشرطة النطاق : 50μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
السهولة التي يمكن استخدامها لانتاج زرع الوهم المستهدفة هي واحدة من القوى العظمى في الزرد كنموذج الفقاريات. وتعديل هذا البروتوكول لا الموصوفة أعلاه يتيح تحليل وظيفة الجين لجينات الأم مع أدوار أساسية في التنمية لاقحي. منذ هذه الأسماك متحولة لا يمكن البقاء على قيد الحياة حتى سن البلوغ ، فمن الضروري لنقل germline متحولة إلى الجنين إلا المضيف من النوع البري ، وخلق "استنساخ germline" من خلايا متحولة. توليد germline الفسيفساء ينطوي زرع الخلايا الجرثومية البدائية من متبرع متحولة إلى الجنين المضيف من النوع البري. خلافا لجميع الأنساب خلية أخرى في الجنين ، يتم تحديد النسب الخلية الجرثومية في وقت مبكر جدا في التنمية من خلال وراثة المحددات الأمهات 5،6. وبالتالي ، فإن التحدي الأول لصنع فسيفساء germline هو تحديد الخلايا الجرثومية البدائية (PGCs) في جنين المانحة. في مراحل لmidblastula PGCs يقيمون على طول 7،8 الهامش ، واختيار الخلايا بحيث تصل 5-10 عشوائية من الهامش من النسب التي تحمل علامات الجنين المانحة النتائج في كثير من الأحيان في نقل PGCs. عندما تحول إلى قطب من الحيوانات الجنين المضيف غير المسماة ، والخلايا الجرثومية البدائية بنشاط من أجل ترحيل التناسلية الافتراضي حيث يمكن التعرف عليهم بشكل لا لبس فيه على 24 ساعة من التنمية من خلال وضعهم المميز ، كبيرة الحجم ، والاحتفاظ صبغ بسبب بطء معدل التكاثري 9-11. وفي الوقت نفسه ، المستمدة من الجهات المانحة غير PGCs ستكتسب مصير يحدده موقعها في المضيف : الدماغ الأمامي في المقام الأول والعينين إذا كانت تنقل إلى القطب الأريمة الحيوانية. حقن الجنين المضيف مع morpholinos أن نهدم الجين مسدود القضاء على نحو فعال germline المضيفة في الخلية بطريقة مستقلة ، بحيث أنه حتى واحدة من الجهات المانحة المستمدة PGC يمكن إعادة الناس الى germline كامل 10،12 (CM ، والمراقبة الشخصية). في الآونة الأخيرة ، وقد وضعت خط المعدلة وراثيا التي تسمح PGCs تصور في الأجنة الحية خلال مراحل الأريمة 13. عندما عبرت الحدود الى وظيفة الأمومة التي متحولة يتم تحديد ، وهذا التحوير ، جنبا إلى جنب مع morpholinos طريق مسدود ، وجعل زرع germline سهلة لأنه يمكن تحديد PGCs واحدة وزرعت في استضافة germline - المنضب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
الشكر لأعضاء لمختبر موينز مدخلات مفيدة أثناء كتابة هذا المقال. هونج كونج هو زميل ما بعد الدكتوراه التي تدعمها المعاهد الوطنية للصحة / معاهد الصحة القومية منح # 5R01HD037909 - 08. CBM هو محقق مع معهد هوارد هيوز الطبي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Injection rig | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | Foot pedal can be ordered separately |
| Pronase | Sigma-Aldrich | P5147 | protease type XIV” |
| Pen-Strep | Sigma-Aldrich | P4458 | 100x stock |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M-0387 | |
| Fluorescent dextrans | Molecular Probes, Life Technologies | various | Eg. lysine-fixable rhodamine dextran (D7162) |
| Injection pipettes (1.2mmx0.94mmx10cm) | Sutter Instrument Co. | BF120-94-10 | |
| Transplant pipette option 1 | World Precision Instruments, Inc. | TW100-4 | |
| Transplant pipette option 2 | VWR international | #53508-400 | |
| micromanipulator | Narishige International | UMJ-3FC (?) | |
| Micromanipulator magnetic stand | Narishige International | GJ-1 | |
| Transplant apparatus | Sutter Instrument Co. | MI-10010 | |
| Fine micromanipulator | Narishige International | MMO-203 | |
| Depression slides | Fisher Scientific | 12560A | |
| Agar molds for injection and transplants | AL-AN Mfg, Inc. | ||
Reagents: Recipes for many of the reagents used for these procedures are found in The Zebrafish Book, which is available in full online at http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Recipes are provided there for preparation of Fish Water, Embryo Medium with and without antibiotics, pronase for dechorionating, fluorescent dextrans, and methyl cellulose. |
|||
References
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. , 3rd Ed, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M. Cell lineage and developmental potential of cells in the zebrafish embryo. Trends Genet. 4, 68-74 (1988).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. Origin and organization of the zebrafish fate map. Development. 108, 581-594 (1990).
- Woo, K., Fraser, S. E. Order and coherence in the fate map of the zebrafish nervous system. Development. 121, 2595-2609 (1995).
- Raz, E. Primordial germ-cell development: the zebrafish perspective. Nat Rev Genet. 4, 690-700 (2003).
- Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells. Development. 124, 3157-3165 (1997).
- Koprunner, M., Thisse, C., Thisse, B., Raz, E. A zebrafish nanos-related gene is essential for the development of primordial germ cells. Genes Dev. 15 (21), 2877-2885 (2001).
- Weidinger, G., Wolke, U., Koprunner, M., Klinger, M., Raz, E. Identification of tissues and patterning events required for distinct steps in early migration of zebrafish primordial germ cells. Development. 126 (23), 5295-5307 (1999).
- Weidinger, G. Regulation of zebrafish primordial germ cell migration by attraction towards an intermediate target. Development. 129 (1), 25-36 (2002).
- Ciruna, B. Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germ-line replacement. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14919-14924 (2002).
- Waskiewicz, A. J., Rikhof, H. A., Moens, C. B. Eliminating zebrafish pbx proteins reveals a hindbrain ground state. Dev Cell. 3, 723-733 (2002).
- Weidinger, G. dead end, a novel vertebrate germ plasm component, is required for zebrafish primordial germ cell migration and survival. Curr Biol. 13, 1429-1434 (2003).
- Blaser, H. Transition from non-motile behaviour to directed migration during early PGC development in zebrafish. J Cell Sci. 118, 4027-4038 (2005).
