Ein In-vitro- FluoroBlok Tumor Invasion Assay

Published: July 20, 2009 doi: 10.3791/1475

Jeff Partridge¹, Paula Flaherty¹

¹BD Biosciences, Discovery Labware

Summary

Dieses Video zeigt, wie man Zellen Invasion durch Zellkultur-Einsätze mit einem Fluoreszenz-basierten Methoden zu messen.

Abstract

Das Markenzeichen von metastatischen Zellen ist ihre Fähigkeit, durch die Basalmembran dringen und wandern in andere Teile des Körpers. Die Zellen müssen in der Lage, sowohl sezernieren Proteasen, die zum Abbau der Basalmembran sowie wandern, um zu invasiv. BD BioCoat Tumor Invasion System bietet Zellen mit Bedingungen, die Bewertung ihrer invasive Eigenschaft erlauben

Protocol

Post-Kennzeichnung und Messung mittels BD Calcein AM Fluoreszenzfarbstoff

Die Zellen sind für die Quantifizierung bezeichnet, nachdem sie durch die BD Matrigel Matrix eingedrungen sind und durch die BD FluoroBlok Membran. Als Ergebnis kann nur Endpunkt Messung der Zell-Invasion erreicht werden.

Wachsen Zellen auf ~ 80% Konfluenz.
Vorbereiten und rehydrieren die Insert-System.
1. Entfernen Sie das Paket von -20 ° C Lagerung und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur kommen.
2. Öffnen Sie die Folienverpackung und fügen 500 mL warmen (37 ° C) Medien in das Innere des Einsatzes Brunnen. Lassen Sie die Platte für 2 Stunden bei 37 rehydrieren ° C, 5% CO _2.
  Hinweis: Es ist nicht notwendig, die unbeschichteten BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert-System, das als Zellmigration Steuerung verwendet werden rehydrieren.
3. Nach Rehydrierung, entfernen Sie vorsichtig das Medium aus dem Einsatz Brunnen, ohne die Schicht der BD Matrigel Matrix auf der Membran. Das System ist nun einsatzbereit.
Bereiten Zellsuspensionen von trypsinizing Zellmonoschichten und Resuspendieren der Zellen in serumfreiem DMEM mit 5 x 10 ⁴ Zellen / ml.
Hinweis: Wenn Sie einen anderen Zelltyp sind, müssen Sie die optimale Aussaatdichte bestimmen. Zur Bestimmung der optimalen Aussaatdichte für Ihren Zelltyp auf einer porösen Oberfläche Wachstum, nutzen eine Reihe von Aussaatdichten (Zellen / cm ^2), dass die Träger der Aussaatdichte auf porösen Oberflächen verwendet (dh Flaschen, Schüsseln und Teller). Zum Beispiel, wenn Sie derzeit Samen bei 2,5 x 10 ⁵ Zellen / cm ^2, Saatgut an verschiedenen Zell-Konzentrationen zwischen 5 x 10 ⁴ und 5 x 10 ⁵ Zellen / cm ^2, um die optimale anfängliche Aussaatdichte bestimmen.
Add 500 ul Zellsuspension (2,5 x 10 ⁴ Zellen) zur apikalen Kammern.
Add 750 ul von Lockstoff (5% FBS in DMEM) auf jeden der basalen Kammern, mit der Probe-Ports für den Zugriff.
Inkubieren Sie die BD BioCoat Tumor Invasion System und die unbeschichtete BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Einlegeplatte für 20-22 Stunden bei 37 ° C, 5% CO _{2-Atmosphäre.}
Nach der Inkubation vorsichtig Medium aus dem apikalen Kammern. Dies kann durch flicking den Inhalt in einen Abfallbehälter erreicht werden. Berühren Sie nicht die Unterseite des Einsatzes System.
Übertragen Sie die Insert-System in einen zweiten 24-Well-Platte mit 500 ul / Vertiefung von 4 pg / mL Calcein AM in HBSS. Inkubation für 1 Stunde bei 37 ° C, 5% CO _2. Die Calcein AM-Lösung ist nicht von der unteren Kammer vor dem Lesen Fluoreszenz entfernt werden, da es sich um eine nicht-fluoreszierenden Vitalfarbstoffs, die in grün fluoreszierendes Calcein durch cytosolische Esterasen umgewandelt wird.
Fluoreszenz der befallenen Zellen ist bei Wellenlängen von 494/517 nm (Ex / Em) auf einem Bottom-Lektüre fluoreszierenden Platte gelesen. Der Gain-Einstellung müssen empirisch ermittelt werden, aber einen Mittelpunkt erhalten sollten eine ausreichende Ausgangspunkt sein. Ein Gain-Einstellung, die zu hoch ist, kann bis zur Sättigung des Detektors mit stark fluoreszierenden Probe führen, dies kann die Übernahme von aussagekräftigen Ergebnissen zu verhindern. Verwendung von Autogain (falls auf Ihrem Leser unterstützt) wird nicht empfohlen. Eine invertierte Fluoreszenzmikroskop können Sie Ihre Ergebnisse zu überprüfen, ist es besonders hilfreich, dies zu tun das erste Mal, wenn Sie diesen Test.
Hinweis: Es ist von größter Bedeutung, dass der Insert-Systeme lesen Sie den richtigen Platte Karte. Informationen zum Einlegen Platte Karten siehe BD Technical Bulletin Nr. 436 auf www.bdbiosciences.com oder kontaktieren BD Technical Support (labware@bd.com). Proper Platte Orientierung ist mit gut A1 in der linken oberen Ecke und die BD Flacon Logo orientiert sich an der rechten Seite, die Platte in das Lesegerät eingelegt wird.

Data Reduction

Die Daten werden wie in der folgenden Gleichung ausgedrückt:

Hintergrund kann vor der Berechnung der prozentualen Zellinvasion abgezogen werden
RFU = relative Fluoreszenz-Einheiten.

Disclosures

Die Autoren sind Mitarbeiter von BD Biosciences, dass Reagenzien und Instrumente in diesem Artikel verwendet produziert.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD BioCoat Tumor Invasion System	BD Biosciences	354165 or 354166
HT-1080 and NIH/3T3 cells	ATCC
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM; serum-free)
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, without calcium and magnesium (DPBS)
BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert System to be used as a cell migration control	BD Biosciences	351157 or 351158
5% Fetal Bovine Serum in DMEM
BD Calcein AM Fluorescent Dye	BD Biosciences	354216 or 354217
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS)
BD Falcon 24-well plates for post cell invasion labeling	BD Biosciences	351147
Fluorescence plate reader with bottom reading capabilities	PerkinElmer EnVision (R), TECAN Infinite (R), Molecular Devices SpectraMax (R), BioTek Synergy (TM), BMG LABTECH PHERAstar.

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References

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