Summary
Contrôle et analyse des circuits neuronaux
Abstract
Notre compréhension des circuits neuronaux - comment ils arbitrer les calculs que cette sensation subserve, la pensée, l'émotion et l'action, et comment ils sont corrompus dans les troubles neurologiques et psychiatriques - serait grandement facilitée par une technologie de cibler rapidement les gènes de 3 complexes - dimensions circuits neuronaux, permettant la création rapide de "niveau circuit transgéniques." Nous avons récemment développé des méthodes d'encodage dans lequel des virus sensibles à la lumière des protéines peuvent sensibiliser les types de cellules spécifiques à la milliseconde-calendrier d'activation et de réduire au silence dans le cerveau intact. Nous présentons ici la conception et la mise en œuvre d'un tableau d'injection capable de délivrer des virus (ou d'autres liquides) à des dizaines de points définis au sein de la structure en 3 dimensions du cerveau (
Protocol
1. Construire Clamp stéréotaxique
- La pince stéréotaxique est utilisé pour attacher le tableau injecteur à l'stereotax, de sorte que les injecteurs sont parallèles au bras stéréotaxique.
- Chaque laboratoire ne nécessite qu'une seule pince, sauf s'il est prévu que plus d'une chirurgie peuvent avoir lieu simultanément. Dans ce cas, faire le même nombre que le nombre maximum prévu de chirurgies simultanées. Il pourrait aussi être conseillé de faire une supplémentaire, en cas de dommages à la première.
- Pour rendre le collier stéréotaxique, premièrement, d'un diamètre de 1,5 mm extérieur (OD) canule en acier est coupé à deux pouces de longueur, et l'une des extrémités est Dremeled jusqu'à ce plat.
- Ensuite, un petit morceau (environ 0,5 x 0,5 cm) est découpée de PCB proto-pension, pour être utilisé comme une entretoise.
- L'utilisation d'un laser cutter afin de s'assurer que toute réduction faite sont perpendiculaires à la surface du matériau, deux rectangles identiques (1 / 2 "x 3 / 8") sont coupés de 1 / 8 "bâches acrylique, chaque rectangle ayant deux trous circulaires dans les coins opposés du rectangle. Le premier trou a un diamètre de 1,5 mm, et est juste assez grand pour contenir la canule métallique hermétiquement. Le deuxième trou a un diamètre 1 / 16 "(figure 1C).
- La canule métallique est insérée dans le trou de 1,5 mm d'un rectangle, puis dans le trou de 1,5 mm de la seconde. L'extrémité inférieure de la canule est aligné avec la face inférieure du rectangle en bas, formant la forme d'un bâton de hockey.
- Tout en gardant l'entretoise bien eu lieu entre les deux rectangles, cette structure est cimenté par l'aide de la colle chaude autour des trous de 1.5mm canule et, en prenant soin d'éviter de coller l'entretoise sur les rectangles. Pâte à modeler peut être utile pour maintenir les choses ensemble durant ce processus.
- Une fois la colle séchée, une vis 1-72 est insérée dans le trou de 1 / 16 de la partie supérieure des rectangles. Puis un écrou hex 1-72 est vissé sur l'extrémité de la vis de 1-72, et resserré. Les vis et écrou servent à maintenir la pince ensemble.
- Pour fixer l'écrou sur la face inférieure du rectangle en bas, de petites quantités de 5-minute époxy sont abandonnés sur le bord de l'écrou, sans permettre à l'époxy de pénétrer dans les filets de l'écrou ou la vis. Toute la pâte à modeler est enlevée, et il est confirmé que l'entretoise peut être maintenu fermement en place en serrant la vis.
2. Préparer le système pour le tableau personnalisé injecteur: Hamilton pompe et stereotax
- Le système de réseau injecteur peut être personnalisé pour n'importe quel ensemble de coordonnées dans le cerveau.
- Le premier utilisateur localise coordonnées des sites d'injection souhaitée dans une souris (ou d'autres espèces) Atlas du cerveau, la conversion des coordonnées appropriées utilisées par les stereotax (ici, X, Y et Z les coordonnées). Le nombre de sites d'injection (trois dans les Figures 1A et 1B) seront ci-après appelé k.
- nombre k de 10 seringues Hamilton ul sont placés dans une seringue d'injection / soutirage comme celui d'un appareil de Harvard.
- Ensuite, trois pieds de long morceaux de tuyaux en polyéthylène sont solidement attachés à l'aiguille de chaque seringue Hamilton.
- Pour chaque morceau de tube en polyéthylène, un F-252 manches tube de Upchurch Scientific est glissé sur l'extrémité ouverte et attachée à un adaptateur de tuyau P-627 en utilisant l'écrou et la ferrule incluse, également de Upchurch Scientific.
3. Construire le tableau personnalisé injecteur
- Chaque tableau injecteur est adapté à l'ensemble de coordonnées que l'utilisateur choisit. Cependant, pour des ensembles de coordonnées qui ne diffèrent que par une traduction et / ou de rotation, le même tableau injecteur peut être utilisé.
- Considérant que le X relative et coordonnées Y des sites d'injection, les trous sont percés dans k un PCB proto-conseil d'épaisseur de 1 / 32 ", avec le même espacement relatif. Ces trous sont forés à l'aide d'un moulin et d'un mini Modela 0.011" foret de diamètre de l'Université McMaster-Carr. Veillez à utiliser un faible taux de forage (Z-vitesse) pour éviter de casser ou de l'usure du foret. Avant de retirer la carte du moulin, un rectangle est percé de petits trous autour de l'aide d'un peu plus grand foret de diamètre 1 / 32 ", d'éviter de porter le plus petit code pour l'usine mini peut être généré facilement à l'aide de MATLAB;. Échantillon code est fourni dans les fichiers suivants.
- generate.m - code MATLAB pour générer du code à partir des coordonnées souhaitées Modela
- holes_ex.rml - Code Modela pour sonnerie de forage (huit trous) en proto-pension
- outline_ex.rml - Code Modela pour rectangle autour des trous de forage
- 245 um um OD/100 diamètre interne (ID) tube capillaire en silice fondue, disponible à partir Polymicro Technologies, est coupé en nombre k de 3 morceaux de pouce. Celles-ci comprennent les injecteurs individuels. Une pièce à usage de tubes capillaires est fourré danschacun des trous, pour déblayer les débris, sans obstruer les injecteurs réelle. Les injecteurs sont ensuite insérés à moitié dans chaque trou, de sorte qu'ils sont fermement maintenue et parallèles les uns aux autres. Les injecteurs sont époxy au conseil d'administration, formant la structure de la matrice de l'injecteur. Tout ce qui reste est de couper les injecteurs à la bonne longueur.
- Le tableau de l'injecteur est fixé à la pince stéréotaxique en plaçant un coin de la proto-pension entre les rectangles acrylique, puis en serrant la vis de la pince stéréotaxique. Ensuite, la canule en métal de la pince est attaché à la stereotax, en utilisant le mécanisme de fixation de l'stereotax.
- Tous les suivants se fait sous un microscope. Pour l'un des injecteurs extérieure (qui est, celui qui peut être approché par le côté avec une arête droite, sans heurter aucune des autres injecteurs), la pointe au-delà du fond de la proto-pension est coupé avec des ciseaux. Pour les injections corticales, il est approprié d'avoir l'injecteur s'étendant approximativement 5mm au-delà de la surface de la proto-pension. Pour plus d'injections, ce nombre peut être augmenté par l'augmentation correspondante de la profondeur. La pointe est aplatie avec un outil Dremel. Conseils injecteur peut également être sol avec un angle comme une précaution supplémentaire contre le colmatage, si la précision dans la profondeur est moins importante.
- Ensuite, un point de référence stable est choisi dans la portée du bras stéréotaxique, et le tableau de l'injecteur est déplacé de sorte que la pointe aplatie de l'extérieur injecteur, est à ce point de référence.
- Une seconde injection est choisie, avec ses coordonnées correspondantes. Considéré comme la différence relative en hauteur (direction z) entre les coordonnées injecteur premier et deuxième. Le tableau de l'injecteur est déplacée le long de l'axe Z par cette distance relative. L'injecteur est coupé et la seconde Dremeled à la bonne longueur, de sorte que la pointe de l'injecteur seconde est maintenant à plat et à la hauteur du point de référence. Le tableau injecteur peut être déplacé dans les directions X et Y pour faciliter la comparaison de la pointe d'injecteur avec le point de référence.
- Ce processus d'ajustement est répétée pour les injecteurs restants.
4. Assemblage de l'ensemble du système
- La pince stéréotaxique et personnalisés array injecteur, tous deux déjà construits, sont requises pour cette partie.
- L'extrémité arrière de chaque injecteur (la fin qui n'a pas été taillée) est inséré dans un bleu à manches F-240 tubes et, en utilisant un écrou de P-235 et P-200 férule d'Upchurch Scientific, est fixé à l'adaptateur fileté déjà connecté à la pompe à Hamilton par des tuyaux en polyéthylène. Les instructions du fabricant peuvent être consultés pour plus de détails.
- En utilisant une aiguille de calibre 27, l'huile de silicone est injectée dans le dos des seringues Hamilton afin que le système entier est rempli de la seringue de Hamilton à la pointe de l'injecteur, sans bulles d'air du tout.
- Comme les seringues Hamilton sont re-placé dans la pompe à Hamilton, le plus grand volume possible de l'huile de silicone est maintenu dans les seringues.
- Si l'expérience nécessite plus de seringues que la pompe est conçue pour les (deux dans ce cas), les seringues peuvent être espacées de petits morceaux de plastique (p.ex., casquettes aiguille) pour les maintenir parallèles les uns aux autres, et de s'assurer que toutes les pièces sont poussé par la pompe dans la même mesure. Ou encore, un kit de mise à niveau multi-rack peuvent être achetés auprès de Harvard Apparatus à détenir jusqu'à 10 seringues à la fois.
5. Injections / chirurgie
- Le processus d'injection avec un parallèle injecteur est très similaire à celle de l'injection avec une pipette simple.
- Il est essentiel d'utiliser des recharges lente / infuser taux tout au long de ce processus, parce que le pompage rapide pourrait mettre l'accent sur l'articulation entre les tubes de petits et grands. Poids max Taux: 2 l / min pour le chargement de virus, et 0,1 l / min pour infuser le virus.
- Une souris anesthésiée est placé dans le stereotax, et reste anesthésié toute l'expérience.
- Préparer la souris si nécessaire. Par exemple, avec un scalpel, une seule coupe est faite en bas de la ligne médiane de la peau, d'entre les yeux entre les oreilles. La peau est tirée en arrière pour exposer le crâne, et le fascia est nettoyée. Une pipette de verre tiré est attachée à la stereotax. Les positions des barres d'oreilles sont ajustés jusqu'au bregma et lambda sont alignés à la même hauteur, et afin que la ligne reliant entre eux est parallèle à l'axe des Y de l'stereotax. Les axes de la stereotax sont orientés selon le système de coordonnées dans lequel les coordonnées d'injection ont été calculés. La stéréotaxie est remis à zéro à la pointe de la pipette en verre au bregma, puis l'embout est positionné légèrement au-dessus du crâne à l'X et Y coordonnées de l'un des sites d'injection.
- En utilisant une fraise de dentiste, le crâne en dessous de la pointe est bien rogné jusqu'à ce qu'il y reste une couche extrêmement fine d'os. La pipette en verre peut être inférieureed et a grandi pour vérifier que le trou foré est centrée à la position correcte. En utilisant une aiguille de calibre 30, un petit morceau de la couche est doucement égrappés, à l'X et Y coordonnées correctes, de sorte que la dure-mère est exposée. Ce trou doit être juste assez grand pour accueillir l'un des injecteurs (0,25 de large). Voir Figure 1D pour le diagramme. De cette façon, les petits, 0.25mm trous larges sont faites dans le crâne, à l'X et Y coordonnées correspondant à chaque site d'injection.
- La pipette en verre est jeté dans un contenant pour objets pointus, et le tableau personnalisé injecteur est attaché à l'aide de la pince stereotax stéréotaxique.
- Afin de régler correctement l'angle de la matrice de l'injecteur, deux injecteurs extérieurs sont choisis pour être calibré à un point de référence donné, comme suit. Après l'un des injecteurs est jumelé avec le point de référence, considérer la relative X et Y les distances entre les sites d'injection par rapport à cet injecteur et un autre. Les axes de la stereotax est ajustée de sorte que toute matrice injecteur est déplacé dans le X et Y. directions par ces distances relatives. Si l'injecteur seconde n'est pas maintenant aligné sur le point de référence, la canule métal est desserré et tourné. Ce processus est répété itérativement jusqu'à ce que le réseau de l'injecteur est inclinée correctement.
- Avant de remplir les injecteurs par le virus, les injecteurs sont remplis d'huile de silicone jusqu'à ce que les seringues sont au point 2 pl (ou plus). Cela donne une zone tampon, de sorte que les bulles d'air ou l'obstruction à la pointe peut être facilement retiré en poussant l'huile avant d'utiliser la pompe à Hamilton, sans avoir à recharger l'ensemble du système avec de l'huile de silicone à l'arrière de la seringue, comme décrit précédemment.
- Une pièce stérile de Parafilm est placée sur le crâne, et les injecteurs sont doucement abaissée sur le Parafilm. Pour les coordonnées des profondeurs très variables, une coutume blanchi une partie (par exemple un objet en escalier) pourrait faciliter le chargement.
- Les pièces suivantes supposent que 1 ul de virus est d'être chargé à chaque site (les quantités suivantes doivent être revus à la baisse si les plus petites quantités sont souhaités). Afin de garantir que> 1 pl de virus est injecté dans chaque site, 1,5 l de virus est à la pipette sur l'Parafilm ou un escalier à l'extrémité de chaque injecteur.
- Avec le taux de remplissage de la pompe à Hamilton mis à 1 l / min, 1,2 ul du virus est rempli dans chaque injecteur.
- La pointe de la plus longue de l'injecteur est remis à zéro au bregma, puis le tableau de l'injecteur est déplacé à l'X et Y coordonnées de l'injecteur. Si colmatage est un problème, dire si de nombreuses cibles profondes sont impliqués: avant même d'insérer les astuces injecteur dans le cerveau, il est parfois conseillé de commencer l'infusion de la pompe, jusqu'à ce que le virus peut être vu sortant de tous les conseils injecteur. Cela supprime les bulles d'air à l'extrémité d'injection, et assure également qu'il n'ya pas de colmatage. Dans le cas de colmatage, la pompe à Hamilton est d'insuffler une impulsion brève à une vitesse supérieure de 2 pl / min, pour doucement vider colmatage.
- Le tableau de l'injecteur est alors abaissée, à travers les petits trous faits avec des aiguilles de calibre 30, à la bonne profondeur Z.
- 1 pl de virus est injecté par chaque injecteur, à 0,1 ul / min.
- Les injections sont laissés seuls pendant 30 minutes.
- Après le tableau de l'injecteur est lentement extraite du cerveau, la pompe à Hamilton est d'insuffler à la même vitesse de 0,1 l / min, afin de vérifier le colmatage dans chaque injecteur.
- Puis les injecteurs sont nettoyées par le remplissage et infuser 1,5 ul d'éthanol à 2 pl / min.
- Enfin, les injecteurs sont rechargées avec de l'huile de silicone pour maintenir la zone tampon de 2 pi dans chaque seringue Hamilton.
- Tous les équipements doivent être stérilisés avant et après la procédure, conformément à la biosécurité de votre institution et les protocoles d'utilisation d'animaux.
6. Les résultats représentatifs
Le réseau parallèle injecteur accélère une chirurgie à peu près par un facteur égal au nombre d'injecteurs, sans compter les temps d'installation et de récupération, bien que les temps individuels dépendra de la compétence du praticien. Pour une injection 1 microlitre, nous avons généralement vu l'expression des lentivirus dans une sphère d'environ 1mm de diamètre (figure 1E). La précision de l'injection a été telle que la variabilité dans le positionnement de pointe, d'un essai à, a été d'environ 45 microns (déviation standard de la distance de la position de la pointe à la position de pointe destiné).
Figure 1. Conception, mise en œuvre, et l'utilisation d'une matrice d'injection du virus parallèle. Un schéma, du système d'injection réseau parallèle, montrant une configuration triple injecteur, pour trois injections simultanées. B, photographie d'un tableau injecteur triple parallèle comme schématisé Une .
Discussion
Ces dernières années, un certain nombre d'organismes génétiquement codés sensibilisateurs optiques ont permis neurones à être activé et fait taire in vivo d'une manière temporellement précise, en réponse à des impulsions brèves de lumière (par exemple, 1,4,5,6,7,8 , 11). Une méthode clé avec laquelle les neurones ont été sensibilisés à la lumière dans le cerveau des mammifères, se fait par des virus tels que les lentivirus et virus adéno-associés (AAV), qui peuvent délivrer des gènes codant pour des opsines au cerveau des animaux allant des souris aux singes, dans un manière sûre et durable (par exemple, 2,9,10). Virus laisser le temps d'exécution plus rapide que ne le font les transgéniques, en particulier pour les organismes qui ne sont pas des organismes modèles génétiques comme les rats et les singes, et pour opsines peut permettre des niveaux d'expression élevés qui peuvent ne pas être possible dans des scénarios transgéniques. Ici nous démontrons une gamme parallèle injecteur capable de créer, dans un délai rapide ", au niveau circuit transgéniques», permettant à l'ensemble des structures du cerveau en 3 dimensions pour être viralement ciblée d'un gène, en une seule étape chirurgicale. Le tableau injecteur comprend un ou plusieurs pompes volumétriques que chaque lecteur un ensemble de seringues, dont chacun se nourrit dans un verre de silice-polyimide / capillaire via un connecteur haute pression tolérant. Les capillaires sont de taille, puis inséré dans, endroits désirés spécifiés par la coutume, un conseil de fraisage positionnement stéréotaxique, permettant ainsi à des virus ou d'autres réactifs pour être livré à l'ensemble des régions du cerveau désirée. Pour utiliser l'appareil, le chirurgien remplit d'abord le sous-système fluidique entièrement avec de l'huile, des remblais des capillaires avec le virus, insère le dispositif dans le cerveau, et infuse lentement réactifs (<0,1 ul / min).
Cette technologie permettra à une grande variété de nouveaux types d'expériences, telles que milliseconde calendrier d'arrêt de façon complexe en forme de structures (telles que l'hippocampe) à des moments précis au cours de comportement, l'inactivation temporellement précise des structures bilatérales qui peuvent agir de manière redondante (tels que l'amygdale gauche et droite), et la perturbation de plusieurs régions cérébrales discrètes (par exemple, conduire deux régions reliées en opposition de phase pour étudier comment la Croix-région dépend de l'activité synchronie dans chaque région, ou de stimuler les entrées d'une région tout en taire un sous-ensemble de les cibles afin de comprendre lequel des plusieurs cibles sont essentielles pour la médiation des effets de ces entrées). Pour un grand cerveau comme celles chez le primate, dans lequel nous avons récemment démontré optiques de type cellulaire d'activation spécifique de neurones 3, perturbant l'activité dans une zone behaviorally pertinente peut exiger l'étiquetage virale de grandes structures complexes. Nous notons que les tableaux parallèles injecteur peut être utilisé pour injecter près de toute charge utile - les médicaments, les neuromodulateurs, des neurotransmetteurs, ou même des cellules - en 3-D complexes schémas dans le cerveau, d'une manière temporellement précis. Enfin, du point de vue de translation, il est possible que la rapidité, la thérapie génique patient personnalisés ou des dispositifs de délivrance de médicaments peuvent être rapidement personnalisés conçus et fabriqués pour correspondre à géométries cerveau individuel, en soutenant de nouveaux traitements pour une variété de pathologies, potentiellement grâce à l'utilisation des molécules de contrôle optique.
Les tableaux injecteurs sont conçus pour être précis, à la fois spatialement et volumétrique. Dans le X et Y-directions, ceci est accompli par le forage des trous placés de façon très précise en utilisant un moyen peu coûteux de mini-moulin, avec les trous juste assez grand pour accueillir les injecteurs, de sorte que les injecteurs sont tenues parallèlement les uns aux autres, et de manière précise emplacement. Dans la direction Z, les injecteurs sont coupés à l'aide d'un appareil de stéréotaxie, permettant un niveau de précision équivalente à celle de la chirurgie stéréotaxique lui-même. La précision volumétrique découle de la précision de la pompe à Hamilton, ainsi que les proches de zéro volume mort connecteurs, adapté de la chromatographie liquide à haute pression (CLHP) sur le terrain. Les injecteurs sont fabriqués à partir de tube capillaire en silice fondue, ce qui est solide et assez rigide qu'il maintient la forme et un espacement précis sous pression, sans l'épaisseur plus grande muraille de solutions de rechange telles que des canules en acier. De petites modifications peuvent facilement être faits pour adapter le réseau parallèle injecteur à une variété d'expériences. Par exemple, si un plus petit volume de virus ou de l'espacement plus fine est nécessaire, les petits tubes capillaires peuvent être employés, avec un peu plus petit foret correspondant. Les futurs appareils peuvent utiliser des canaux microfluidiques et des pompes, pour augmenter le nombre d'injecteurs parallèlement, de minimiser la taille (peut-être permettant à ces dispositifs pour être montés sur la tête des animaux se déplacent librement).
Disclosures
Toutes les procédures ont été en conformité avec le Guide du NIH pour les animaux de laboratoire et approuvés par le soin des animaux du MIT et de l'emploi et des comités de biosécurité.
Acknowledgments
ESB admet un financement par le Prix du directeur des NIH Innovateur Nouvelle (DP2 OD002002-01), le NIH subvention défi 1RC1MH088182-01, le NIH Opportunités Grand-Grant 1RC2DE020919-01, le NIH 1R01NS067199-01, la NSF (0835878 et 0848804), le Programme McGovern Institute Award Neurotechnology , le ministère de la Défense, NARSAD, la Fondation Alfred P. Sloan, Jerry et Marge Burnett, le Prix de recherche SFN pour l'innovation en neuroscience, le MIT Media Lab, la Fondation Benesse, et le Wallace H. Coulter Foundation.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dremel Tool | Tool | Dremel | 3956-02 | |
| Laser Cutter | Tool | Universal Laser Systems | VLS2.30 | |
| Hot glue gun | Tool | Stanley Bostitch | GR20 | |
| Injection/withdrawal syringe pump (Hamilton pump) | Tool | Harvard Apparatus | 702001 | |
| 10 μl Hamilton syringes | Tool | Hamilton Co | 701N | Need one per injection site |
| Mouse stereotax | Tool | Stoelting Co. | 51725D | |
| Modela mini-mill | Tool | Roland | MDX-15 | |
| 0.011" diameter drill bit for mini mill | Tool | McMaster-Carr | 8915A12 | |
| 1/32" diameter drill bit For mini-mill | Tool | McMaster-Carr | 8848A35 | |
| High speed dental drill | Tool | Lynx | 333 | |
| Dental drill accessories | Tool | Pearson Assessments | F 35-08-25 F 35-07-10 P 86-02-38 | |
| 1.5mm outer diameter (OD) stainless steel cannula | Material | Small Parts, Inc. | HTX-15R | |
| 1-72 binding slotted machine screw | Material | Small Parts, Inc. | MX-0172B | |
| 1-72 hex nut | Material | Small Parts, Inc. | HNX-0172 | |
| PCB proto-board, 1/32" thick | Material | Digi-Key | PC57-T-ND | |
| Acrylic Sheet, 1/8" thick | Material | McMaster-Carr | 8560K239 | |
| HPLC connectors | Material | Upchurch Scientific | F-252, P-627, P-200, P-235, F-240 (some of these can be bought in 10-packs; simply add an ‘x’ to the end of the part number) | Need one per injection per site, except F-252, P-627, and P-235, which can be reused |
| Fused silica capillary tubing, OD: 245 μm, ID: 100 μm | Material | Polymicro Technologies | 2000022-10M | |
| 5-minute general purpose epoxy | Material | Permatex | 84101 | 5-minute general purpose epoxy |
| Polyethylene tubing .066 x .095 inch | Material | VWR international | 63018-827 |
References
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