Gli array scalabile fluidico Iniettore per Viral targeting di intatto 3-D circuiti cerebrali

Summary

Controllare e analizzare i circuiti neurali

Abstract

La nostra comprensione dei circuiti neurali - come mediare i calcoli che servono alla sensazione, pensiero, emozione e azione, e come essi sono danneggiati nei disordini neurologici e psichiatrici - sarebbe molto facilitata da una tecnologia di targeting dei geni a rapida complessa 3 - dimensionale circuiti neurali, permettendo la creazione veloce di "livello di circuito transgenici". Abbiamo recentemente sviluppato metodi in cui la codifica dei virus sensibili alla luce per le proteine ​​possono sensibilizzare i tipi di cellule specifiche per millisecondo, tempi di attivazione e silenziamento nel cervello intatto. Noi qui presenti la progettazione e realizzazione di un array iniettore in grado di erogare virus (o altri fluidi) di decine di punti definiti all'interno della struttura 3-dimensionale del cervello (

Protocol

1. Costruire Morsetto Stereotassica

1. Il morsetto stereotassica viene utilizzato per collegare l'array iniettore al stereotax, in modo che gli iniettori sono parallele al braccio stereotassica.
2. Ogni laboratorio ha bisogno di un solo morsetto, a meno che non si prevede che più di un intervento chirurgico può avvenire contemporaneamente. In questo caso, fanno lo stesso numero il numero massimo previsto di interventi simultanei. Potrebbe anche essere consigliabile fare un ulteriore, in caso di danni al primo.
3. Per rendere il morsetto stereotassica, in primo luogo, un diametro 1,5 mm esterno (OD) in acciaio cannula viene tagliata a 2 cm di lunghezza, e una delle estremità è Dremeled verso il basso fino piatto.
4. Poi, un piccolo pezzo (circa 0,5 x 0,5 cm) è tagliato fuori PCB proto-board, da utilizzare come un distanziatore.
5. Utilizzando un cutter laser per garantire che eventuali riduzioni effettuate sono perpendicolari alla superficie del materiale, due rettangoli uguali (1 / 2 "x 3 / 8") sono tagliati da 1 / 8 "fogli di acrilico, ogni rettangolo con due fori circolari in angoli opposti del rettangolo. La prima buca ha un diametro 1,5 mm, ed è solo abbastanza grande da contenere la cannula metallica ermeticamente. Il secondo foro ha diametro 1 / 16 "(Figura 1C).
6. La cannula in metallo è inserito nel foro 1,5 mm di un rettangolo, poi attraverso il foro di 1,5 mm di secondo. L'estremità inferiore della cannula è allineato con la faccia inferiore del rettangolo in basso, formando la forma di un bastone da hockey.
7. Pur mantenendo il distanziatore saldamente tenuto tra i due rettangoli, questa struttura è cementata insieme utilizzando colla a caldo intorno ai fori cannula e 1,5 mm, facendo attenzione ad evitare di incollare le distanziatore per i rettangoli. Plastilina può essere utile a tenere insieme le cose durante questo processo.
8. Dopo che la colla si è asciugata, un 1-72 vite è inserito nel 1 / 16 buche dal lato superiore dei rettangoli. Poi un 1-72 dado esagonale che si avvita sulla fine della vite 1-72, e serrati. La vite e il dado servono a tenere insieme il morsetto.
9. Per collegare il dado esagonale per la faccia inferiore del rettangolo in basso, piccole quantità di 5 minuti a resina epossidica sono sceso intorno al bordo del dado esagonale, senza permettere la resina epossidica per ottenere nei filetti del dado esagonale o vite. Qualsiasi plastilina viene rimosso e si conferma che il distanziatore può essere tenuto saldamente stringendo la vite.

2. Preparazione del sistema per l'array personalizzati iniettore: Hamilton pompa e stereotax

1. Il sistema array iniettore può essere personalizzato per qualsiasi serie di coordinate nel cervello.
2. Il primo utente individua le coordinate dei siti di iniezione desiderato in un mouse (o altre specie) atlante del cervello, la conversione in coordinate appropriato utilizzato dal stereotax (qui, X, Y e Z-coordinate). Il numero di siti di iniezione (tre in Figure 1A e 1B) sarà d'ora in poi essere chiamato k.
3. k numero di siringhe da 10 microlitri Hamilton si trovano in una iniezione / prelievo pompa a siringa come questo da apparecchi di Harvard.
4. Prossimo, 3-piede-lungo pezzi di tubo in polietilene sono saldamente collegato al l'ago della siringa ogni Hamilton.
5. Per ogni pezzo di tubo in polietilene, un F-252 manicotto tubo dal Upchurch scientifico è scivolato sopra l'estremità aperta e collegata ad un P-627 adattatore di tubi utilizzando il dado inclusa e puntale, anche da Upchurch scientifico.

3. Costruire la matrice su misura Injector

1. Ogni array iniettore è personalizzato per l'insieme di coordinate che l'utente sceglie. Tuttavia, per i set di coordinate che differiscono solo per uno / o di traduzione e di rotazione, l'array stesso iniettore può essere utilizzato.
2. Considerando solo le coordinate X e Y relativo dei siti di iniezione, fori k sono perforati in un PCB proto-board di spessore 1 / 32 ", con la stessa spaziatura relativo. Questi fori sono realizzati utilizzando un mulino e un mini Modela 0,011" Diametro punta da trapano da McMaster-Carr. Assicurarsi di utilizzare una bassa velocità di foratura (Z-velocità) per evitare di rompere o usura la punta del trapano. Prima di rimuovere la scheda dal mulino, un rettangolo è forato intorno i piccoli fori, con una punta più grande del diametro 1 / 32 ", per evitare di indossare il più piccolo codice per il mulino mini possono essere generati facilmente utilizzando MATLAB;. Campione codice viene fornito nei seguenti file.
   1. generate.m - codice MATLAB per la generazione di codice Modela dalle coordinate desiderato
   2. holes_ex.rml - codice Modela per suoneria foratura (otto buche) in Proto-board
   3. outline_ex.rml - codice Modela per rettangolo intorno ai fori di trivellazione
3. 245 micron OD/100 micron diametro interno (ID) tubi capillare di silice fusa, disponibile da Technologies Polymicro, è tagliato in numero k di 3 pezzi pollici. Questi comprendono gli iniettori singoli. Un pezzo di tubo capillare monouso è colpito conciascuno dei fori, per eliminare i detriti senza intasare gli iniettori reale. Gli iniettori sono poi inseriti a metà strada in ogni foro, in modo che si tengono strettamente e parallele l'una all'altra. Gli iniettori sono incollate alla tavola, che formano la struttura dell'array iniettore. Tutto ciò che rimane è quella di tagliare gli iniettori alla lunghezza corretta.
4. L'array iniettore è collegato al morsetto stereotassica mettendo un angolo del proto-board tra i rettangoli acrilico, e poi stringendo la vite del morsetto stereotassica. Successivamente, la cannula metallica del morsetto è collegato al stereotax, utilizzando il meccanismo di fissaggio del stereotax.
5. Tutti i seguenti è fatta sotto un microscopio. Per uno degli iniettori esterno (che è, uno che può essere affrontato dal lato con un regolo, senza sbattere contro nessuna delle altri iniettori), la punta si estende oltre la parte inferiore del proto-board è tagliato con le forbici. Per preparazioni iniettabili corticale, è opportuno avere l'iniettore una estensione di circa 5 millimetri al di là della superficie del proto-board. Per i più iniezioni, questo numero può essere aumentato dal corrispondente aumento in profondità. La punta è appiattito con un utensile Dremel. Suggerimenti iniettore può essere anche terra in un angolo come ulteriore precauzione contro l'intasamento, se la precisione in profondità è meno importante.
6. Poi, un punto di riferimento stabile viene scelto all'interno del raggio del braccio stereotassica, e l'array iniettore viene spostato in modo che la punta appiattita del iniettore esterno, è a questo punto di riferimento.
7. Un secondo iniettore è scelto, insieme con le sue coordinate corrispondenti. Considerato è la differenza relativa in altezza (direzione z) tra le coordinate primo e il secondo iniettore. L'array iniettore è spostato lungo l'asse Z da questa distanza relativa. L'iniettore secondo è tagliato e Dremeled alla lunghezza corretta, in modo che la punta di un iniettore secondo è ora piatta e all'altezza del punto di riferimento. L'array iniettore può essere spostato in direzione X e Y per facilitare il confronto della punta iniettore con il punto di riferimento.
8. Questo processo di taglio viene ripetuto per gli iniettori rimanenti.

4. Assemblare l'intero sistema

1. Il morsetto stereotassica e personalizzati serie iniettore, entrambi già costruiti, sono necessari per questa parte.
2. Il back-end di ogni iniettore (alla fine che non è stato tagliato) viene inserito in un blu di F-240 manica tubi e, usando un dado P-235 e P-200 puntale da Upchurch scientifico, è collegato all'adattatore filettato già collegato alla pompa Hamilton da tubi in polietilene. Le istruzioni del produttore è consultabile per i dettagli.
3. Usando una 27-gauge, olio di silicone viene iniettato nella parte posteriore delle siringhe Hamilton in modo che l'intero sistema viene riempito dalla siringa Hamilton alla punta iniettore, senza bolle d'aria a tutti.
4. Come le siringhe Hamilton sono ri-collocati in pompa di Hamilton, il volume massimo possibile di olio di silicone viene mantenuta in siringhe.
5. Se l'esperimento richiede più siringhe che la pompa è progettata per (due in questo caso), le siringhe possono essere distanziati con piccoli pezzi di plastica (per esempio, tappi ago) per tenerli paralleli l'uno all'altro, e per garantire che tutti i pezzi sono spinto dalla pompa nella stessa misura. O, un multi-rack kit di aggiornamento possono essere acquistati presso Apparato Harvard per contenere fino a 10 siringhe in una volta.

5. Iniezioni / chirurgia

1. Il processo di iniezione con un parallelo iniettore è molto simile a quella di iniettare con una pipetta singola.
2. E 'indispensabile l'utilizzo di ricarica lenta / tassi di infondere in tutto questo processo, perché veloce pompaggio potrebbero stressare la giunzione tra tubi grandi e piccoli. Consigliato rate massimo: 2 microlitri / min per il caricamento del virus, e 0,1 microlitri / min per infusione di virus.
3. Un mouse anestetizzato si trova nel stereotax, e resta anestetizzato per tutto l'esperimento.
4. Preparare il mouse, se necessario. Ad esempio, con un bisturi, un unico taglio è fatto lungo la linea mediana della pelle, da in mezzo agli occhi di tra le orecchie. La pelle è tirata indietro per esporre il cranio, e la fascia è rimosso. Una pipetta di vetro tirato è collegato al stereotax. Le posizioni delle barre dell'orecchio sono regolati fino bregma e lambda sono allineati alla stessa altezza, e in modo che la linea che li collega è parallela l'asse Y del stereotax. Gli assi del stereotax sono orientati secondo il sistema di coordinate in cui le coordinate di iniezione sono stati calcolati. Il stereotassica viene azzerato con la punta della pipetta di vetro a bregma, poi la punta è posizionata leggermente sopra il cranio al X e Y le coordinate di uno dei siti di iniezione.
5. Utilizzando un trapano dentistico, il teschio sotto la punta è attentamente confrontato via fino a quando rimane uno strato estremamente sottile di tessuto osseo. La pipetta di vetro può essere inferioreed e cresciuto a verificare che il foro è perforato è centrato nella posizione corretta. Usando un 30-gauge, un piccolo pezzo di livello è leggermente raccolti al largo, al corretto X e Y-coordinate, in modo che la dura madre è esposta. Questo buco dovrebbe essere solo grande abbastanza da contenere una delle iniettori (0,25 mm di larghezza). Vedi Figura 1D per diagramma. In questo modo, i piccoli, fori 0,25 millimetri sono fatte largo nel cranio, al X e Y coordinate corrispondenti a ciascun sito di iniezione.
6. La pipetta di vetro viene scartato in un apposito contenitore, e l'array personalizzati iniettore è collegato al stereotax utilizzando il morsetto stereotassica.
7. Al fine di impostare correttamente l'angolo del vettore iniettore, due iniettori esterni sono scelti per essere calibrato a un punto di riferimento, come segue. Dopo uno degli iniettori è abbinato con il punto di riferimento, si consideri la relativa X e Y distanze tra i siti di iniezione iniettore rispetto a questo e altro. Gli assi del stereotax sono regolate in modo che tutta la serie iniettore viene spostata nel X e Y direzioni da questi distanze relative. Se l'iniettore seconda non è ora allineato con il punto di riferimento, la cannula metallica è allentato e ruotato. Questo processo viene ripetuto iterativamente fino a quando l'array iniettore è angolato in modo corretto.
8. Prima di riempire gli iniettori con il virus, gli iniettori sono pieni di olio di silicone fino a quando le siringhe sono al punto 2 microlitri (o superiore). Ciò fornisce una zona cuscinetto, in modo che eventuali bolle d'aria o di intasamento nella punta può essere facilmente rimosso spingendo in avanti con l'olio della pompa di Hamilton, senza dover ricaricare l'intero sistema con olio di silicone dal retro delle siringhe, come descritto in precedenza.
9. Un pezzo di Parafilm sterile è posto sul cranio, e gli iniettori sono leggermente abbassati sui Parafilm. Per le coordinate con profondità molto diverse, una custom-fresato parte (ad esempio un oggetto a forma di scala) potrebbe facilitare il caricamento.
10. Le parti che seguono presuppongono che 1 ml di virus per essere caricato in ogni sito (le seguenti quantità dovrebbe essere ridimensionato se piccole quantità sono desiderati). Al fine di garantire che> 1 ml di virus viene iniettata in ogni sito, 1,5 ml di virus è pipettato sul Parafilm o scale in punta di ciascun iniettore.
11. Con il tasso di riempimento della pompa Hamilton set a 1 microlitri / min, 1,2 ml di virus è riempito in ogni iniettore.
12. La punta più lunga l'iniettore è azzerato al bregma, e poi l'array iniettore è spostata a X e Y coordinate di tale iniettore. Se l'intasamento è un problema, dire se molti obiettivi in ​​profondità sono coinvolti: anche prima di inserire i suggerimenti iniettore nel cervello, a volte è consigliabile iniziare l'infusione di pompa, fino a virus può essere visto emergere da tutte le iniettore punte. Ciò elimina le bolle d'aria alle estremità iniettore, e inoltre assicura che non c'è intasamento. Nel caso di intasamento, la pompa Hamilton è impostato per infondere un breve impulso ad una velocità superiore di 2 microlitri / min, per eliminare delicatamente intasamento.
13. L'array iniettore è poi abbassato, attraverso i piccoli fori fatti con i 30-gauge aghi, per la corretta profondità Z.
14. 1 ml di virus viene iniettato attraverso ogni iniettore, a 0,1 microlitri / min.
15. Le iniezioni sono lasciati soli per 30 minuti.
16. Dopo l'array iniettore sta lentamente estratte dal cervello, la pompa Hamilton è impostato per infondere allo stesso tasso di 0,1 microlitri / min, al fine di verificare la presenza di ostruzioni in ogni iniettore.
17. Allora gli iniettori sono puliti da ricarica e infondendo 1,5 ml di etanolo a 2 microlitri / min.
18. Infine, gli iniettori sono riempiti con olio di silicone per mantenere la zona 2 microlitri di buffer in ogni siringa Hamilton.
19. Tutte le attrezzature devono essere sterilizzati prima e dopo la procedura, in base alla biosicurezza del vostro istituto e protocolli di utilizzo.

6. Rappresentante Risultati

L'array parallelo iniettore accelera un intervento chirurgico o meno di un fattore pari al numero di iniettori, senza contare l'installazione e il tempo di recupero, anche se i tempi individuali dipenderà dalla capacità del praticante. Per una iniezione 1 microlitro, di solito visto l'espressione lentivirus in una sfera di diametro di circa 1 mm (Fig. 1E). La precisione dell'iniezione era tale che la variabilità nel posizionamento punta, da prova a prova, era di circa 45 micron (deviazione standard della distanza dalla posizione di punta nella posizione di punta previsto).

Figura 1. Progettazione, implementazione e utilizzo di un array parallelo virus iniettore. A, schematica del parallelo sistema array iniettore, che mostra una configurazione tripla iniettore, per tre iniezioni simultanee. B, la fotografia di una triplice serie parallela iniettore come diagramma in A . morsetto stereotassica, mostrato a grandi linee dall'alto D, illustrazione della tecnica per una efficiente, riducendo al minimo i danni-, apertura di fori nel cranio per iniettore inserimento nel cervello:. con un trapano dentistico, il cranio sottile spessore fino a circa 50 micron, quindi utilizzare la punta di un ago affilato per aprire una piccola craniotomia. E, immagine che mostra fluorescenza channelrhodopsin-2 (ChR2)-GFP-etichettata cellule in tre regioni corticali del mouse, come bersaglio l'array triplo iniettore mostrato in B.

Discussion

Negli ultimi anni, un certo numero di sensibilizzatori ottici geneticamente codificato neuroni hanno permesso di essere attivato e messo a tacere in vivo in un preciso temporalmente-moda, in risposta a brevi impulsi di luce (ad esempio, ^{1,4,5,6,7,8 , 11).} Un metodo chiave con cui i neuroni sono stati sensibilizzati alla luce nel cervello dei mammiferi, avviene tramite virus come lentivirus e virus adeno-associati (AAV), che può fornire geni che codificano per opsine al cervello di animali che vanno dai topi alle scimmie, in un modo sicuro e duraturo (ad esempio, ^2,9,10). I virus permettono tempi di risposta più veloci di quanto non facciano transgenici, soprattutto per gli organismi che non sono organismi modello genetico, come ratti e scimmie, e per opsine può consentire alti livelli di espressione che non può essere possibile in scenari transgenici. Qui mostriamo una serie parallela iniettore in grado di creare, in tempi rapidi, "a livello di circuito transgenici", consentendo l'intero 3-dimensionale strutture cerebrali per essere virale mirati con un gene, in un unico passaggio chirurgico. L'array iniettore comprende una o più pompe che ogni unità di una serie di siringhe, ognuna delle quali si inserisce in un poliammide / capillare in silice fusa mediante un alta pressione-tolerant connettore. I capillari sono dimensionati, e quindi inserito in, posizioni desiderate specificato da custom-fresatura una scheda stereotassica posizionamento, permettendo virus o altri reagenti da consegnare il set desiderato di regioni del cervello. Per usare il dispositivo, il chirurgo prima riempie il sottosistema fluidico interamente con olio, backfills i capillari con il virus, inserisce il dispositivo nel cervello, e infonde reagenti lentamente (<0,1 microlitri / min).

Questa tecnologia consentirà una vasta gamma di nuovi tipi di esperimenti, come millisecondo-temporale chiusura di strutture a forma complessa (come ad esempio l'ippocampo) in momenti precisi durante il comportamento, l'inattivazione temporalmente precisa di strutture bilaterali che possono agire in modo ridondante (come a sinistra ea destra amigdala), e la perturbazione di molteplici regioni cerebrali distinti (per esempio, guidare due regioni collegati fuori fase per studiare come cross-regione sincronia dipende attività all'interno di ogni regione, o stimolanti input per una regione, mentre a tacere un sottoinsieme di gli obiettivi al fine di capire quale dei diversi obiettivi sono fondamentali per mediare gli effetti di tali ingressi). Al posto del cervello di grandi dimensioni come quelli del primate, in cui abbiamo recentemente dimostrato ottica delle cellule di tipo specifico di attivazione neurale ^3, conturbante attività in una comportamentale rilevante per zona può richiedere l'etichettatura virale di grandi strutture complesse. Prendiamo atto che gli array parallelo iniettore può essere utilizzato per iniettare praticamente qualsiasi carico utile - droga, neuromodulatori, neurotrasmettitori, o addirittura le cellule - in complesso i modelli 3-D nel cervello, in un preciso modo temporalmente. Infine, dal punto di vista traslazionale, è possibile che rapida, paziente personalizzati terapia genica o dispositivi di somministrazione dei farmaci può essere rapidamente appositamente progettati e realizzati per soddisfare geometrie cervello individuale, sostenendo i nuovi trattamenti per una serie di patologie, potenzialmente, mediante l'uso di molecole di controllo ottico.

Gli array iniettori sono progettati per essere precisi, sia spazialmente e volumetricamente. In X e Y direzioni, questo viene realizzato dalla perforazione fori molto accuratamente posizionati usando un economico mini-mill, con i fori appena grande abbastanza da contenere gli iniettori, in modo che iniettori sono paralleli l'uno all'altro, e in un preciso posizione. Nella direzione Z, gli iniettori sono tagliati utilizzando un apparato stereotassico, permettendo un livello di precisione equivalente a quello della chirurgia stereotassica stesso. La precisione volumetrica nasce dalla precisione della pompa Hamilton, così come il vicino allo zero volume morto connettori, adattato dal alta pressione cromatografia liquida (HPLC) campo. Gli iniettori sono in tubi capillare di silice fusa, che è forte e sufficientemente rigida che mantiene la forma precisa e la spaziatura sotto pressione, senza lo spessore della parete maggiore di alternative come cannule di acciaio. Piccole modifiche possono facilmente essere fatto per adattare l'array parallelo iniettore ad una serie di esperimenti. Per esempio, se un minor volume di virus o di spaziatura più fine è richiesto, più piccolo tubo capillare può essere impiegato, insieme a un po 'più piccolo trapano corrispondente. Futuri dispositivi possono utilizzare canali microfluidica e pompe, per aumentare il numero di iniettori in parallelo, per minimizzare le dimensioni (forse consenta a tali dispositivi da montare sulla testa di muoversi liberamente gli animali).

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Dremel Tool	Tool	Dremel	3956-02
Laser Cutter	Tool	Universal Laser Systems	VLS2.30
Hot glue gun	Tool	Stanley Bostitch	GR20
Injection/withdrawal syringe pump (Hamilton pump)	Tool	Harvard Apparatus	702001
10 μl Hamilton syringes	Tool	Hamilton Co	701N	Need one per injection site
Mouse stereotax	Tool	Stoelting Co.	51725D
Modela mini-mill	Tool	Roland	MDX-15
0.011" diameter drill bit for mini mill	Tool	McMaster-Carr	8915A12
1/32" diameter drill bit For mini-mill	Tool	McMaster-Carr	8848A35
High speed dental drill	Tool	Lynx	333
Dental drill accessories	Tool	Pearson Assessments	F 35-08-25 F 35-07-10 P 86-02-38
1.5mm outer diameter (OD) stainless steel cannula	Material	Small Parts, Inc.	HTX-15R
1-72 binding slotted machine screw	Material	Small Parts, Inc.	MX-0172B
1-72 hex nut	Material	Small Parts, Inc.	HNX-0172
PCB proto-board, 1/32" thick	Material	Digi-Key	PC57-T-ND
Acrylic Sheet, 1/8" thick	Material	McMaster-Carr	8560K239
HPLC connectors	Material	Upchurch Scientific	F-252, P-627, P-200, P-235, F-240 (some of these can be bought in 10-packs; simply add an ‘x’ to the end of the part number)	Need one per injection per site, except F-252, P-627, and P-235, which can be reused
Fused silica capillary tubing, OD: 245 μm, ID: 100 μm	Material	Polymicro Technologies	2000022-10M
5-minute general purpose epoxy	Material	Permatex	84101	5-minute general purpose epoxy
Polyethylene tubing .066 x .095 inch	Material	VWR international	63018-827