Summary
Контроль и анализ нейронных цепей
Abstract
Наше понимание нейронные цепи, - как они посредником вычислений, которые subserve ощущения, мысли, эмоции и действия, и как они повреждены в неврологических и психических расстройств - будет в значительной мере способствовало технологии для быстрой ориентации гены комплекса 3 - мерных нейронных цепей, быстрого создания "сеансового уровня трансгенных". Мы недавно разработали методы, в которых вирусы кодировки для светочувствительных белков может внимания специфические типы клеток к миллисекунд сроки активации и глушителей в интактном мозге. Мы здесь присутствует разработке и реализации массива инжектор, способных доставлять вирусы (или другой жидкости) в десятки определенных точках в течение 3-мерной структуры головного мозга (
Protocol
1. Построение стереотаксической Clamp
- Стереотаксической зажим используется для подключения массива инжектор stereotax, так что форсунки параллельно стереотаксической руку.
- Каждая лаборатория нужен только один зажим, если предполагается, что более чем одной операции может происходить одновременно. В этом случае, сделать столько же, сколько ожидается максимальное количество одновременных операций. Было бы также целесообразно сделать дополнительно, в случае повреждения в первую очередь.
- Для того, чтобы стереотаксической зажим, во-первых, 1,5 мм Внешний диаметр (OD) стали канюля сократить до 2 дюймов в длину, и один из концов Dremeled вниз, пока квартиры.
- Далее, небольшой кусочек (примерно 0,5 х 0,5 см), вырезанных из печатных плат прото-доски, которые будут использоваться в качестве прокладки.
- Использование лазерного резака, чтобы гарантировать, что любые сокращения сделаны перпендикулярны к поверхности материала, два идентичных прямоугольника (1 / 2 "х 3 / 8") вырезаны из 1 / 8 "акриловая пленка, каждый прямоугольник с двумя круглыми отверстиями в противоположных углах прямоугольника. первое отверстие имеет диаметр 1,5 мм, а всего лишь достаточно большой для хранения металла канюля плотно. второе отверстие имеет диаметр 1 / 16 "(рис. 1в).
- Металла канюля вводится в 1,5 мм отверстие один прямоугольник, а затем через 1,5 мм отверстие секунду. Нижний конец канюли совмещена с нижней поверхности нижнего прямоугольника, образуя форму хоккейной клюшки.
- Сохраняя прокладки плотно состоялся между двумя прямоугольниками, эта структура является склеены с помощью горячего клея вокруг канюли и 1,5 мм отверстия, соблюдая осторожность, чтобы избежать склеивания прокладку к прямоугольников. Моделирование глины может быть полезно держать вещи в этом процессе.
- После высыхания клея, 1-72 винт вставляется в 1 / 16 отверстие с верхней стороны прямоугольника. Затем 1-72 шестигранная гайка накручивается на конец 1-72 винт, и подтянутым. Винтом и гайкой служить провести зажим вместе.
- Чтобы прикрепить гайку на нижней поверхности нижнего прямоугольника, небольшое количество 5-минутный эпоксидный удаляются вокруг края шестигранной гайки, не давая эпоксидные, чтобы попасть в нити гайку или винт. Любой пластилин удаляется, и это подтвердили, что прокладка может быть прочно удерживается на месте с помощью ужесточения винт.
2. Подготовка системы для индивидуальных массив инжектор: Гамильтон насоса и stereotax
- Система инжектора массив может быть настроен, чтобы практически любой набор координат, в головном мозге.
- Сначала пользователь находит координаты желаемого места инъекций в мышь (или другие виды) атлас мозга, превращая в соответствующие координаты используются stereotax (здесь X-, Y-и Z-координаты). Число инъекций (по три на рисунках 1А и 1В) в дальнейшем будет называться K.
- К числу 10 мкл шприцы Hamilton находятся в инъекции / вывода шприцевой насос, подобные этой, из аппарата Гарварда.
- Следующая, 3-х футов длиной куски полиэтиленовой трубы надежно прикреплены к игле шприца каждого Гамильтон.
- За каждый кусок полиэтиленовой трубы, F-252 трубы рукав из Апчерч Научно является скользила по открытым концом и прикреплен к P-627 трубка адаптера с помощью прилагаемой гайкой и наконечником, а также из Апчерч Scientific.
3. Построение массива Индивидуальные инжектор
- Каждый массив инжектор настроена на набор координат, что пользователь выбирает. Однако, для набора координат, которые отличаются только по письменному и / или вращения, и тот же массив инжектор может быть использован.
- Учитывая только относительное X и Y координаты места инъекций, к сверлят отверстия в печатной плате прото-совета толщиной 1 / 32 ", с той же относительной расстояние. Эти отверстия сверлят использованием мельницы MODELA мини и 0,011" диаметр сверла от Мак-Мастер-Карр. Обязательно используйте медленные темпы бурения (Z-скорость), чтобы избежать поломки или износа сверла. Перед удалением платы с мельницы, прямоугольник пробурено около маленькие отверстия, используя сверло большего диаметра 1 / 32 ", чтобы избежать износа меньшую Код для мини-мельницы могут быть созданы легко с помощью MATLAB;. Образце код содержится в следующих файлах.
- generate.m - MATLAB код для генерации кода из MODELA искомые координаты
- holes_ex.rml - MODELA код для бурения звонка (восемь отверстий), в Прото-борту
- outline_ex.rml - MODELA код для бурения прямоугольник вокруг отверстия
- 245 мкм OD/100 мкм внутренний диаметр (ID) плавленого кварца капиллярная трубка, которую можно получить Polymicro технологий, разрезают на число к 3-дюймовые части. Они включают отдельные форсунки. Одноразовые кусок капиллярной трубки является ткнул черезкаждое из отверстий, чтобы убрать мусор и не засорять фактического инжекторов. Инжекторы затем вставляется на полпути в каждое отверстие, так, чтобы они плотно прижаты и параллельно друг другу. Инжекторы epoxied к доске, образуя структуру массива инжектора. Все, что остается только урезать инжекторов до требуемой длины.
- Массив инжектора прикрепляется к стереотаксической зажим путем размещения одного угла прото-плате между акриловых прямоугольников, а затем, затянув винт стереотаксической зажимом. Затем металл канюли из зажима крепится к stereotax, используя вложение механизм stereotax.
- Все следующие делается под микроскопом. Для одного из внешних потребителей инъекционных наркотиков (то есть тот, что можно подойти с бок с прямым краем, не натыкаясь на какой-либо из других форсунок), наконечник, выходящие за нижнюю часть прото-борт режется ножницами. Для коркового инъекции, целесообразно иметь инжектор расширения примерно 5 мм за пределы поверхности прото-доски. Для более глубоких инъекций, это число может быть увеличено соответствующим увеличением глубины. Наконечник плоский с Dremel инструмент. Инжектор советы могут быть также землей под углом в качестве дополнительной меры предосторожности против засорения, если точность в глубине менее важно.
- Далее, стабильная точка отсчета выбирается в пределах досягаемости стереотаксической руку, и массив инжектор перемещается так, чтобы плоский кончик внешнего инжектор, на этом точку отсчета.
- Второй инжектор выбрана, вместе со своими соответствующими координатами. Рассмотрено относительная разница в высоте (г-направлении) между первой и второй координаты инжектора. Массив инжектор перемещается вдоль оси Z этим относительное расстояние. Второй инжектор обрезается и Dremeled до требуемой длины, так, чтобы кончик второй инжектор теперь плоская и на высоте исходной точки. Массив инжектор может быть перемещен в X и Y направлениях для облегчения сопоставления инжектор наконечник с точки отсчета.
- Этот процесс отделки повторяется для оставшихся форсунок.
4. Сборка всей системы
- Стереотаксической зажим и индивидуальные массив инжектор, как уже построенных, которые требуются для этой части.
- Задней части каждой форсунки (конец, который не был без пробелов) вставляется в синей F-240 трубка рукава и с помощью P-235 орех и P-200 наконечник из Апчерч Научные, прикрепляется к резьбовой адаптер уже подключен к насосу Гамильтон полиэтиленовой трубы. Инструкции производителя можно ознакомиться подробнее.
- Использование 27-иглы, силиконовое масло вводят в заднюю шприцов Гамильтон так, чтобы вся система заполнена из шприца Гамильтона до кончика инжектор, без пузырьков воздуха на всех.
- Как Гамильтон шприцы повторно помещен в насос Гамильтон, максимально возможный объем силиконовое масло хранится в шприцах.
- Если эксперимент требует больше шприцов, чем насос предназначен для (два в данном случае), шприцы могут быть расположены с небольшими кусочками пластика (например, иглы колпачки), чтобы держать их параллельно друг другу, и обеспечить, чтобы все части толкнул насоса в той же степени. Или, мульти-стойки комплект модернизации могут быть приобретены аппараты Гарвардского провести до 10 шприцев сразу.
5. Инъекции / хирургии
- Процесс инъекции параллельно инжектор очень похож на потребителей инъекционных с одной пипетки.
- Важно, чтобы использовать медленные пополнения / влить ставки на протяжении всего этого процесса, так как быстрое насосных могло бы поставить акцент на совместной между большими и малыми труб. Рекомендуемая максимальная скорость: 2 мкл / мин для загрузки вирусов и 0,1 мкл / мин для вливая вируса.
- Наркозом мышь находится в stereotax и остается под наркозом в течение всего эксперимента.
- Подготовка мыши по мере необходимости. Например, с помощью скальпеля, один надрез вдоль средней линии кожи, с места между глазами между ушей. Кожа отстранился подвергать черепа, и фасции убирается. Вытащил стеклянную пипетку прилагается к stereotax. Позиции ухо баров корректируются до брегмы и лямбда построены в соответствии с той же высоты, и так, чтобы линия, соединяющая их параллельно Y-ось stereotax. Осей stereotax ориентированы в соответствии с системой координат, в которой инъекции координаты были рассчитаны. Стереотаксической обнуляется с кончика стеклянной пипетки на темя, а затем конец находится на расстоянии чуть выше черепа на X-и Y-координаты одной из инъекций.
- Использование бормашины, череп ниже кончика тщательно сравнению подальше, пока остается очень тонкий слой кости. Стеклянную пипетку может быть нижеред и вырос проверить, что отверстие ведется бурение является центром в правильном положении. Использование 30-иглы, крошечный кусочек слой осторожно снимается, при правильном X-и Y-координат, так что твердая мозговая оболочка подвергается. Это отверстие должно быть достаточно большой, чтобы соответствовать одной из форсунок (0,25 мм в ширину). См. рисунок 1D для диаграммы. Таким образом, маленькая, 0,25 мм широкие отверстия сделаны в черепе, в X-и Y-координаты, соответствующие каждой инъекции.
- Стеклянную пипетку отбрасывается в контейнере острых и настроить массив инжектора прикрепляется к stereotax использованием стереотаксической зажимом.
- Для того, чтобы правильно установить угол массив инжектор, два внешних инжекторов выбираются так, чтобы быть откалиброван до заданной точки, следующим образом. После одного из инжекторов сочетается с точкой отсчета, рассмотрим относительную X-и Y-расстояние между инъекций относительно этого инжектора и еще один. Осей stereotax подбираются таким образом, что весь массив инжектор перемещается в X-и Y-направлениях эти относительные расстояния. Если второй инжектор сейчас не приведены в соответствие с точкой отсчета, канюли металл ослабил и вращать. Этот процесс повторяется многократно, пока массив инжектор угловой правильно.
- Перед заполнением инжекторы с вирусом, инжекторы заполнены силиконовым маслом, пока шприцы на 2 мкл точки (или выше). Это обеспечивает буферную зону, так что любые воздушные пузыри или засорения наконечника может быть легко удалена нажатием нефти вперед, используя насос Гамильтон, без необходимости пополнения всей системы с силиконовым маслом с задней шприцы, как было описано ранее.
- Стерильный кусок парафильмом делается на череп, и инжекторы мягко опускается на парафильмом. Для координаты с сильно отличаться по глубине, специально фрезерованные части (например, лестница форме объекта) может способствовать загрузке.
- Следующих частей считать, что 1 мкл вируса должен быть загружен на каждом участке (следующие величины должно быть уменьшено, если она меньше величины желаемого). Для того, чтобы гарантировать, что> 1 мкл вируса вводится на каждом участке, 1,5 мкл вируса пипеткой на парафильмом или лестница на кончике каждой форсунки.
- При пополнении скорость насоса Гамильтон установлен в 1 мкл / мин, 1,2 мкл вируса заправленные в каждую форсунку.
- Кончике длинного инжектор обнуляется на темя, а затем массив инжектор смещается в X-и Y-координаты, что инжектор. Если засорение вопрос, скажем, если многие глубинные цели участвуют: даже перед вставкой инжектор советы в мозг, что иногда целесообразно начать насос вливая, пока вирус можно увидеть выходящим из всех инжектор советы. Это устраняет любые воздушные пузыри на инжекторе советы, а также гарантирует, что нет засорения. В случае засорения, насос Гамильтон настроен, чтобы вселить короткого импульса на более высокой скорости 2 мкл / мин, чтобы мягко очистить засорение.
- Массив инжектор затем снизились, через маленькие отверстия сделаны с 30-иглы, к правильному Z-глубины.
- 1 мкл вируса вводят через каждый инжектор, по 0,1 мкл / мин.
- Инъекции оставили в покое в течение 30 минут.
- После массив инжектор медленно извлечь из мозга, насос Гамильтон настроен, чтобы вселить в то же размере 0,1 мкл / мин, с тем чтобы проверить, не засорились в каждой форсунки.
- Затем форсунки очищаются заправки и вливая 1,5 мкл этанола в 2 мкл / мин.
- Наконец, инжекторы тару, заполненную силиконовым маслом для поддержания 2 мкл буферной зоны в каждом шприце Hamilton.
- Все оборудование должно быть стерилизованы до и после процедуры, в соответствии с биологической безопасности вашей организации и протоколов использования животных.
6. Представитель Результаты
Параллельный массив инжектор ускоряет операции примерно на множитель, равный число потребителей инъекционных наркотиков, не считая установки и время восстановления, хотя отдельные раз будет зависеть от мастерства врача. Для 1 мкл инъекции, мы обычно видели лентивирус выражение в сфере примерно диаметром 1 мм (рис. 1E). Точность инъекция была такова, что изменчивость в наконечник позиционирования, от испытания к испытанию, было около 45 микрон (стандартное отклонение расстояния от кончика состоянии предназначен наконечник положении).
Рисунок 1. Проектирование, реализация и использование параллельных массива вирусов инжектора., Схема параллельной системы массива инжектор, показывая тройной конфигурации инжектор, в течение трех одновременных инъекций. B, фотографии тройной параллельный массив инжектора, как в диаграмме .
Discussion
В последние годы число генетически закодированы оптических сенсибилизаторов позволили нейроны активируются и замолчать в естественных условиях в временно точностью моды, в ответ на короткие импульсы света (например, 1,4,5,6,7,8 , 11). Ключевым методом, с которой нейроны имели возможность ознакомиться с света в мозге млекопитающих, является использование вирусов, таких как лентивирусов и адено-ассоциированные вирусы (ААВ), которые могут доставить гены, кодирующие opsins в мозг животных от мышей до обезьян, в безопасной и прочной одежды (например, 2,9,10). Вирусы позволяют быстрее затрат времени, чем у трансгенных, особенно для организмов, которые не являются генетическими модельных организмов, таких как крысы и обезьяны, и для opsins может позволить высоким уровнем выражение, которое не может быть возможным в трансгенных сценариев. Здесь мы показываем, параллельный массив инжектор способен создать, в быстром сроки ", сеансового уровня трансгенных", позволяющие всем 3-мерной структуры мозга, чтобы быть с вирусно целевой ген, в одном хирургическом шаг. Массив инжектор содержит один или более объемные насосы, что каждый диск набор шприцов, каждый из которых питается в полиимида / из кварцевого стекла с помощью капиллярного высокого давления, устойчивых к разъему. Капилляры размера, а затем вставляется, желаемых местах, указанных на заказ фрезерные стереотаксической борту позиционирование, что позволяет вирусы или другие реагенты для доставки желаемый набор области мозга. Чтобы воспользоваться устройством, хирург сначала заполняет жидкостный подсистемы полностью с маслом, backfills капилляров с вирусом, вставляет устройство в мозг, и вселяет реагенты медленно (<0,1 мкл / мин).
Эта технология позволит широкий спектр новых видов экспериментов, таких, как миллисекунд сроки закрытия сложно форме структуры (например, гиппокамп) в конкретное время поведение, временно точностью инактивации двусторонних структур, которые могут выступать в избыточно (например, левой и правой миндалины), и возмущение нескольких дискретных областях мозга (например, вождение двух соединенных между регионами по фазе, чтобы изучить, как кросс-регион синхронность зависит от деятельности в рамках каждого региона, или стимулирующие вклад в регионе в то время как глушителей подмножество цели, чтобы понять, какая из нескольких целей имеют решающее значение для посреднической последствия этих входов). Для больших мозгов как и на приматах, в котором мы недавно продемонстрировала оптический камерного типа конкретной нейронной активации 3, возмущающих деятельности в поведенчески-соответствующей области могут потребовать вирусной маркировки больших, сложных структур. Отметим, что параллельно массивы инжектор может быть использована для введения практически любую полезную нагрузку - лекарства, нейромодуляторов, нейромедиаторов, или даже клетки - в сложных 3-D модели в головном мозге, в временно-точно. Наконец, из поступательных точки зрения, вполне возможно, что быстрое, пациент настраиваемые генной терапии или устройств доставки лекарственных средств может быть быстро специально разработаны и изготовлены в соответствии с индивидуальными геометрии мозга, поддерживая новые методы лечения различных патологий, возможно за счет использования оптические молекул контроля.
Инжектор массивы предназначены, чтобы быть точным, как в пространстве и объемно. В X-и Y-направлений, это достигается путем бурения очень точно размещены отверстия с использованием недорогих мини-мельницы, с отверстиями достаточно большой, чтобы соответствовать инжекторов, так что инжекторы проходят параллельно друг другу, а в точном местоположения. В Z-направлении, инжекторы отделаны использованием стереотаксической аппарат, позволяющий уровень точности эквивалентна стереотаксической сама операция. Объемной точности возникает из-за точность насоса Гамильтона, а также почти нулевым мертвым объемом разъемов, адаптированных с высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) области. Инжекторы изготавливаются из плавленого кварца капиллярная трубка, которая является сильным и достаточно жестким, что он поддерживает точную форму и расстояние под давлением, не больше толщины стенки альтернативы, такие как сталь канюль. Малые изменения могут быть легко приняты для приведения параллельных массива инжектор для различных экспериментов. Например, если меньший объем вируса или меньшими интервалами не требуется, меньше капиллярной трубки могут быть использованы, наряду с соответствующим меньше сверло. Будущие устройства могут использовать микрожидкостных каналов и насосов, для увеличения числа параллельных инжекторы, чтобы свести к минимуму размеры (возможно, позволяющих такие устройства для установки на головы свободно движущихся животных).
Disclosures
Все процедуры в соответствии с Руководством NIH для лабораторных животных и одобрен Уход Массачусетского технологического института и использованию животных и биобезопасности комитетов.
Acknowledgments
ESB признает, финансирование новых Новатор NIH директора премии (DP2 OD002002-01), NIH вызов Грант 1RC1MH088182-01, NIH Гранд Возможности Грант 1RC2DE020919-01, NIH 1R01NS067199-01, NSF (0835878 и 0848804), Макговерн института нейротехнологии премии программе , Министерство обороны, NARSAD, Альфреда П. Слоуна, Джерри и Мардж Бернетт, премии SFN исследований для инноваций в области неврологии, MIT Media Lab, Benesse Фонда, и Уоллес H. Coulter Foundation.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dremel Tool | Tool | Dremel | 3956-02 | |
| Laser Cutter | Tool | Universal Laser Systems | VLS2.30 | |
| Hot glue gun | Tool | Stanley Bostitch | GR20 | |
| Injection/withdrawal syringe pump (Hamilton pump) | Tool | Harvard Apparatus | 702001 | |
| 10 μl Hamilton syringes | Tool | Hamilton Co | 701N | Need one per injection site |
| Mouse stereotax | Tool | Stoelting Co. | 51725D | |
| Modela mini-mill | Tool | Roland | MDX-15 | |
| 0.011" diameter drill bit for mini mill | Tool | McMaster-Carr | 8915A12 | |
| 1/32" diameter drill bit For mini-mill | Tool | McMaster-Carr | 8848A35 | |
| High speed dental drill | Tool | Lynx | 333 | |
| Dental drill accessories | Tool | Pearson Assessments | F 35-08-25 F 35-07-10 P 86-02-38 | |
| 1.5mm outer diameter (OD) stainless steel cannula | Material | Small Parts, Inc. | HTX-15R | |
| 1-72 binding slotted machine screw | Material | Small Parts, Inc. | MX-0172B | |
| 1-72 hex nut | Material | Small Parts, Inc. | HNX-0172 | |
| PCB proto-board, 1/32" thick | Material | Digi-Key | PC57-T-ND | |
| Acrylic Sheet, 1/8" thick | Material | McMaster-Carr | 8560K239 | |
| HPLC connectors | Material | Upchurch Scientific | F-252, P-627, P-200, P-235, F-240 (some of these can be bought in 10-packs; simply add an ‘x’ to the end of the part number) | Need one per injection per site, except F-252, P-627, and P-235, which can be reused |
| Fused silica capillary tubing, OD: 245 μm, ID: 100 μm | Material | Polymicro Technologies | 2000022-10M | |
| 5-minute general purpose epoxy | Material | Permatex | 84101 | 5-minute general purpose epoxy |
| Polyethylene tubing .066 x .095 inch | Material | VWR international | 63018-827 |
References
- Chow, B., Han, X., Qian, X., Boyden, E. S. High-performance halorhodopsin variants for improved genetically-targetable optical neural silencing. Frontiers in Systems Neuroscience. 2009 Feburary 26, Slat Lake City, Utah, , Computational and systems neuroscience. (2009).
- Bi, A., Cui, J., Ma, Y. P., Olshevskaya, E., Pu, M., Dizhoor, A. M., Pan, Z. H. Ectopic expression of a microbial-type rhodopsin restores visual responses in mice with photoreceptor degeneration. Neuron. 50, 23-33 (2006).
- Han, X., Qian, X., Bernstein, J., Zhou, H., Franzesi, G., Stern, P., Bronson, R., Graybiel, A., Desimone, R., Boyden, E. Millisecond-Timescale Optical Control of Neural Dynamics in the Nonhuman Primate Brain. Neuron. 62 (2), 191-198 (2009).
- Zhang, F., Wang, L. P., Brauner, M., Liewald, J. F., Kay, K., Watzke, N., Wood, P. G., Bamberg, E., Nagel, G., Gottschalk, A., Deisseroth, K. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Han, X., Boyden, E. S. Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity, with single-spike temporal resolution. PLoS ONE. 2, e299-e299 (2007).
- Szobota, S., Gorostiza, P., Del Bene, F., Wyart, C., Fortin, D. L., Kolstad, K. D., Tulyathan, O., Volgraf, M., Numano, R., Aaron, H. L., Scott, E. K., Kramer, R. H., Flannery, J., Baier, H., Trauner, D., Isacoff, E. Y. Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor. Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).
- Lima, S. Q., Miesenbock, G. Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons. Cell. 121 (1), 141-152 (2005).
- Zhang, F., Wang, L. P., Boyden, E. S., Deisseroth, K. Channelrhodopsin-2 and optical control of excitable cells. Nat. Methods. 3, 785-792 (2006).
- Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels. Neurosci Res. 54 (2), 85-94 (2006).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57 (5), 634-660 (2008).
