レンチウイルスを作成するには、DNAベクターは、ヒト293細胞にトランスフェクトされています。収穫後、上清を濃縮し、ウイルス力価は、フローサイトメーターと蛍光式によって決定されます。
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この記事について
サマリー
要約
RNA干渉（RNAi）は、生きた細胞内の遺伝子サイレンシングのシステムです。 RNAi実験では、短い干渉RNA（siRNA）のシーケンスの相同遺伝子は、転写後の状態で沈黙している。ショートヘアピンRNA、siRNAに前駆体は、種々の細胞型におけるRNAiを可能に、レンチウイルスを用いて表現することができる。このようなヒト免疫不全ウイルスのようなレンチウイルスは、感染の両方で割ると、非分裂細胞に対応しています。我々は、レンチウイルスをパッケージ化する手順を説明します。パッケージングは、DNAベクターから有能なウイルスの準備を指します。レンチウイルスベクターの生産システムは、天然のウイルスゲノムは、個々のヘルパープラスミドコンストラクトに分割された"分割"システムに基づいています。 4つの別々のベクターに異なるウイルスの要素のこの分裂は、レンチウイルスゲノムの不定組換えによる複製が可能なウイルスを作成することのリスクを減少させる。ここでは、関心と3種類のパッケージでベクトル（P - VSVG、pRSV、PMDL）のshRNAを含むベクターを、一過性のヒト293細胞にトランスフェクトされています。少なくとも48時間のインキュベーション期間の後、ウイルスを含む上清を回収し、濃縮する。最後に、ウイルスの力価は、レポーター（蛍光灯）フローサイトメーターによる式によって決定されます。
プロトコル
パート1：レンチウイルスを生成するためにHEK 293細胞のトランスフェクション
* 24時間50から70パーセント翌日のコンフルエントのため10 cmディッシュにトランスフェクション、プレート2.5 × 10 6個の細胞の前に。
- 一つ後のウイルスを下すために、単一の細胞をトランスフェクトするとなるとDNAを調製してこのプロトコルを開始します。最初に、FuGENE 6トランスフェクション試薬ロシュ、細胞がDNAを取るように脂質の試薬を希釈する。 1.5 mlチューブに、ピペット30μlのFuGENE 6トランス600ulの無血清培地に（SFDMEM）。それは媒体に配信されるようにトランスフェは、チューブの側面に接触させてように注意してください。このトランスフェと5分間室温でSFDMEMミックスとインキュベートしてみましょう。
- チューブのキャップでは、それぞれの第3世代ウイルスパッケージングベクトル（PMDL、pRSVとpVSV - G）は、4μgのレンチウイルスプラスミド4μgのを混ぜる。レンチウイルスプラスミドは、パッケージングベクターがレンチウイルスを作るために必要なすべての他のタンパク質の遺伝子を含んでいる間、ウイルスは、それが感染するすべての細胞のゲノムに挿入するDNAが含まれています。
- チューブを反転させて蓋をし、混合数回を閉じます。
- 室温で15-2....
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謝辞
サンドラー喘息基礎研究センター（SABRE）
サンドラー財団
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| DMEM、HEK 293T細胞、ペニシリン-ストレプトマイシン、グルタミン、リン酸緩衝生理食塩水、FBS | Invitrogen | ||
| FuGENE 6 トランスフェクション試薬、pSico mCherry、pMDL、pRSV、pVSVG | Roche Group | ||
| 漂白剤 | Clorox | ||
| 10-cm 細胞培養ディッシュ、96ウェル細胞培養プレート | Falcon BD | 353003 | |
| マルチチャンネルピペット | Rainin | ||
| フィルター付きピペットチップ | Rainin | ||
| 1.5ml Eppendorfチューブ、シリンジ、シリンジフィルター (0.45-μm) | Eppendorf | ||
| 超遠心管 | Beckman Coulter Inc. | ||
| 5% CO2 組織培養インキュベーター | Coulter | ||
| Beckman SW41T.I ローター | |||
| Beckman 超遠心機 | Beckman Coulter Inc. | ||
| 蛍光顕微鏡 | Coulter | ||
| FACS Array | Beckman Coulter Inc. |
参考文献
- Reiser, J. Production and concentration of pseudotyped HIV-1-based gene transfer vectors. Gene Therapy. , 72-7211 (2000).
- Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., Mandel, R. J., Nguyen, M., Trono, D., Naldini, L. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
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再版と許可
