Для того, чтобы лентивирусов, ДНК векторы трансфекции в человеческий 293 клеток. После сбора урожая и обогатительное супернатант, титра вируса определяется флуоресценции выражение потока цитометр.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
РНК-интерференция (RNAi) представляет собой систему генов в живых клетках. В RNAi, гены гомологичные последовательности на короткий вмешательства РНК (миРНК) заставляют молчать в посттранскрипционных государства. Короткие РНК шпилька, предшественники миРНК, могут быть выражены с помощью лентивирус, что позволяет RNAi в различные типы клеток. Лентивирусов, такие как вирус иммунодефицита человека, способны заражать обе деления и не делящихся клеток. Опишем процедуру, которая для упаковки лентивирусов. Упаковка относится к подготовке компетентных вирус из ДНК векторы. Лентивирусов производственных систем вектора основаны на "разбить" система, где естественный вирусный геном был разделен на отдельные вспомогательные плазмиды конструкций. Это расщепление различных вирусных элементов на четыре отдельных векторов уменьшает риск создания репликации вируса, способного придаточных рекомбинации лентивирусов генома. Здесь вектор, содержащий shRNA интересов и три вектора упаковки (р-VSVG, pRSV, pMDL) являются временно трансфекции в человеческий 293 клеток. После по меньшей мере 48-часовой инкубации вируса содержащих супернатант собирают и концентрируют. Наконец, титра вируса определяется репортера (флуоресцентные) выражение потока цитометр.
Протокол
Часть 1: Трансфекция HEK 293 клеток продуцировать лентивирусов
* 24 часов до трансфекции, пластины 2,5 • 10 6 клеток в 10 см блюдо для слияния 50-70% на следующий день.
- Начало этому протоколу, подготовив ДНК, с которой позже один трансфекции клетки, чтобы сделать вирус. Во-первых, разбавленный FuGENE 6 Трансфекция реагента Roche, липидный реагентов, которые делают клетки занимают ДНК. В 1,5 мл трубки, пипетки 30μl FuGENE 6 в 600ul бессывороточной среде (SFDMEM). Будьте осторожны, чтобы не позволить FuGENE сенсорным стороне трубки, как он будет доставлен в среду. Пусть это FuGENE и SFDMEM перемешать и инкубировать при....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Благодарности
Сандлер Астма фундаментальных исследований Центра (SABRE)
Сандлер фонда
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| DMEM, клетки HEK 293T, пенициллин-стрептомицин, глутамин, фосфатно-солевой буфер, FBS | Invitrogen | ||
| Реагент для трансфекции FuGENE 6, pSico mCherry, pMDL, pRSV, pVSVG | Roche Group | ||
| Отбеливатель | Clorox | ||
| Чашки для культивирования клеток 10 см, 96-луночные планшеты для культивирования клеток | Falcon BD | 353003 | |
| Многоканальный дозатор | Rainin | ||
| Фильтрованные наконечники для дозатора | Rainin | ||
| Пробирки Eppendorf 1.5 мл, шприц, шприцевой фильтр (0.45-μm) | Eppendorf | ||
| Пробирки для ультрацентрифугирования | Beckman Coulter Inc. | ||
| Инкубатор для культур тканей с 5% CO2 | Coulter | ||
| Ротор Beckman SW41T.I | |||
| Ультрацентрифуга Beckman | Beckman Coulter Inc. | ||
| Флуоресцентный микроскоп | Coulter | ||
| Система FACS Array | Beckman Coulter Inc. |
Ссылки
- Reiser, J. Production and concentration of pseudotyped HIV-1-based gene transfer vectors. Gene Therapy. , 72-7211 (2000).
- Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., Mandel, R. J., Nguyen, M., Trono, D., Naldini, L. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
