Wir beschreiben detaillierte Verfahren für die effiziente Transfektion von Plasmid-DNA in die Fasern der Fußmuskulatur von lebenden Mäusen mittels Elektroporation und der nachfolgenden Darstellung der Proteinexpression mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie.
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Methodenartikel
DNA Transfektion von Säuger Skelettmuskulatur mit In Vivo Elektroporation
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Ein wachsendes Interesse in der Zellbiologie ist transgen zu veränderten Formen der essentiellen Proteine (zB fluoreszenzmarkierten Konstrukte und / oder mutierte Varianten) auszudrücken, um ihre endogene Verteilung und funktionelle Bedeutung zu untersuchen. Ein interessanter Ansatz, der umgesetzt wurde, um dieses Ziel in ausdifferenzierten Zellen erfüllen, ist der
Protokoll
Experimentelle Verfahren zur in-vivo-Elektroporation von FDB und IO Muskeln
- Vor Beginn der in vivo Elektroporation Protokolle müssen Säugetieren Expressionsplasmide verstärkt um die Konzentration im Bereich von auf 2-5 pg Plasmid / ul TE Hinweis ergeben werden:. Wir verwenden routinemäßig kommerzielle Verstärkung Kits und folgen Sie den Hersteller "Verfahren. Gewerbliche Expressionsplasmide Durchführung der CMV-Promotor arbeiten sehr gut im Skelettmuskel in vivo Transfektionen.
- Aliquot das notwendige Volumen (10-20 ul) der Plasmid-Lösung und speichern Sie sie in zwei 0,5 ml Eppendorf-Röhrchen (eine für jeden Fu....
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Diskussion
Wir beschreiben hier die einzelnen Schritte, die folgten, um eine effektive Transfektion von DNA-Plasmiden in Skelettmuskelfasern erreichen durch in vivo Elektroporation werden sollte. Die wesentlichen Vorteile unseres Ansatzes sind die Einfachheit der Implementierung und ihrer minimalen Invasivität, die in vernachlässigbarer Gefahr für die Gesundheit der Tiere führt. In Wirklichkeit haben die oben beschriebene Elektroporation Protokolle nicht erfordert weit mehr als zwei subkutane Injektionen pro Fuß, durch ei.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Wir danken Dr. T. Otis, Department für Neurobiologie, UCLA, für die gemeinsame Nutzung der TPLSM Anlage mit uns, Dr. C. Fahlke, Institut für Physiologie, RWTH Aachen, Deutschland, für die freundliche Spende der pEYFP-ClC1 Plasmid, und Herr . R. Serrano für den technischen Support. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von NIH / NIAMS gewährt AR047664 und AR54816 unterstützt.
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Referenzen
- Muangmoonchai, R., Wong, S., Smirlis, D., Phillips, I., Shephard, E. Transfection of liver in vivo by biolistic particle delivery. Molecular Biotechnology. 20 (2), 145-151 (2002).
- DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. Voltage-....
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Nachdrucke und Genehmigungen
