Summary
自从詹姆斯汤姆森等人在1998年开发出一种技术，隔离，并在文化中成长的胚胎，已成为供以后使用，从冻结的股票解冻和扩大细胞的冷冻细胞进行常规胚胎干细胞培养中的重要程序。由于胚胎干细胞的冷冻和解冻的压力非常敏感，必须特别小心。在这里，我们表现出适当的技术迅速解冻胚胎干细胞从液氮股，对小鼠胚胎馈线细胞电镀，慢慢冻结他们长期储存。
Abstract
自詹姆斯汤姆森
Protocol
1。解冻胚胎干细胞
预实验设置
- 前一天，解冻胚胎干细胞，板照射的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），CF1的应变，MEF培养液中的明胶涂层的6孔组织培养板（D - MEM培养基辅以滋养层10％热灭活胎牛血清和1％非必需氨基酸）。孵育过夜，在37 ° C和5％的CO 2。
- 的胚胎干细胞从液氮中删除之前，一定要在所有必要的设备和试剂，并准备使用，以确保有效和成功的解冻。
解冻胚胎干细胞
- 从液氮存储罐使用金属镊子取出的胚胎干细胞的低温小瓶。
- 卷为3-5秒，戴手套的手之间的小瓶删除霜冻。
- 在小瓶标签上记录的信息。
- 使用金属镊子，浸入37℃水浴的小瓶。瓶轻轻摇动，并观察解冻的进展往往小瓶光看到冰晶的大小（但很快！）。不要淹没在水浴小瓶上限，因为这可能污染的细胞。
- 当仍然只是一个很小的冰晶，淹没整个小瓶中的乙醇消毒。
- 在无菌的生物安全柜，低温瓶中的内容直接传送到15 mL锥形管的底部。
- 慢慢胚胎干细胞培养液中添加4毫升（D-MEM/F-12培养基与血清替代20％的淘汰赛，1％非必需氨基酸，1％L -谷氨酰胺，0.2％β-巯基乙醇和4纳克/补充毫升碱性成纤维细胞生长因子）管。轻轻摇动，新媒体添加到管，以不断混合细胞。
- 5分钟后，细胞离心200 × G.
电镀的胚胎干细胞
- 虽然胚胎干细胞在离心机，准备通过适当的胚胎干细胞的信息标签MEF馈线板：细胞株，传代次数，及解冻日期。
- 当有左旋转时间约2分钟，吸MEF培养液中加入1.0毫升的PBS井。
- 带颗粒的胚胎干细胞的生物安全柜，并认真吸取上清液。小心不吸细胞沉淀，但消除尽可能上清，这个解决方案包含从冻结介质DMSO。
- 重悬沉淀，轻轻胚胎干细胞培养液中加入2.5毫升用5 mL的玻璃吸管，移液3-4次。
- 以及从MEF馈线的PBS吸，慢慢加入6孔板准备好所有的胚胎干细胞悬液2.5毫升。
- 放置到37℃孵化器板，小心地将板着回来，方方，均匀地分布在整个以及细胞。不要旋流板的圆形图案，以避免集中在中心的殖民地。
- 允许细胞在37 ° C和5％的CO 2一夜之间重视。
- 解冻后的一天，取出培养基（与任何浮动细胞），新鲜胚胎干细胞培养液中加入2.5毫升的良好。
- 可选：移除的介质和细胞可以被转移到一个单独的准备MEF的接驳板。这一步往往会产生新的殖民地，从原来的解冻细胞的同时，可培养的。
- 孵育37 ° C和5％的CO 2一夜之间板块。
2。冷冻胚胎干细胞
- 虽然胚胎干细胞在离心机，标签内的生物安全柜的低温，小瓶，包括细胞系，传代次数，和冻结日期。典型的冷冻胚胎干细胞的密度为每低温瓶细胞（从6孔板）。
- 当胚胎干细胞，离心，生物安全柜带来的管。从管吸上清，小心不要去打扰松散包装的细胞沉淀。
- 重悬细胞沉淀与胚胎干细胞培养液中适量：0.5毫升胚胎干细胞每低温瓶中的培养基。移液时，胚胎干细胞复苏时更好地冻结在比较大的殖民地件很温柔。
- 慢慢地，一边轻轻摇晃试管，2X胚胎干细胞冷冻培养基（60％定义胎牛血清，20％的胚胎干细胞培养液中，20％二甲基亚砜）添加适量（0.5毫升，每离心管）的细胞。补充说，一旦冻结介质吸管解决方案非常轻轻一到两倍混合
- 很快，但轻轻地，加1毫升细胞悬液，以每低温小瓶。
- 异丙醇冷冻集装箱和地方转移到小瓶一个-80 ° C冰箱过夜。细胞将冻结在1℃每分钟异丙醇冷冻集装箱。
- 翌日，迅速转移冷冻瓶液氮储存罐，使用金属镊子。
代表性的成果
人类胚胎干细胞解冻后的第一天，可能会出现小菌落透明和可能难以在显微镜下看到。由于刚解冻的胚胎干细胞往往增殖缓慢，他们可能需要几天的时间，显示为建立殖民地（图1）。
图1。细胞的复苏和增长 。胚胎干细胞从液氮解冻成像 1，7日和11日解冻后。
Discussion
附带的视频演示解冻和冷冻胚胎干细胞的方法。应在液态氮中冷冻细胞解冻后尽快洗澡，以获得最佳的复苏。记住，要非常小心，移液解冻细胞时，：尽量减少处理的细胞和吸管轻轻。一小瓶胚胎干细胞可以被镀到任何一个6孔板，或4孔板井，并立即放置在孵化器。由于在四个独立的井培养减少失去整个文化污染的可能性，并可以更容易地找到胚胎干细胞克隆较小的表面积，4孔板时，建议第一次解冻胚胎干细胞。
解冻后的胚胎干细胞的第一天，菌落很小，可能是透明的。每天补充的胚胎干细胞培养液，殖民地，即使在显微镜下明显，因为它可能需要几天在文化为胚胎干细胞出现为建立殖民地。重要的是使用新鲜镀的MEF饲养层细胞解冻时，殖民地常常不能达到一个合适的大小，传代后，直到10月12日解冻。
解冻时的胚胎干细胞的低传小瓶，这是很好的做法，扩大和冻结额外的小瓶，保持低传代细胞，为未来的文化和实验的股票。定期冻结所有“额外”的健康胚胎干细胞保持冻结的股票，这也是一个好主意。作为高品质的，无差别的，积极除以胚胎干细胞克隆的最成功的解冻和随后的文化被冻结。胚胎干细胞恢复冻结，更有效地处理较大的细胞聚集轻轻。最后的总大小应该是相似的（或稍大）后例行通过镀聚合的大小。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM | Invitrogen | 11965-092 | For MEF mediumjavascript:void(0); |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Certified | Invitrogen | 16000-044 | Heat-inactivated For MEF medium |
| D-MEM/F-12 | Invitrogen | 11330-057 | |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | Pre-screen to ensure support of hES cells |
| bFGF | Stemgent | 03-0002 | Use at [4 ng/mL] final |
| Non-essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-050 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 200 mM (100X) Use at [1X] final |
| PBS | Invitrogen | 14190-250 | Without Ca2+ or Mg2+ |
| Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12 |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | Type A, Porcine |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2560 | For freezing medium |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Defined | Hyclone | SH300.70.01 | For freezing medium |
| 6-well plates | Nalge Nunc international | 140675 | For general culture |
| 4-well plates | Nalge Nunc international | 176740 | For thawing |
| 5 mL glass pipettes | Fisher Scientific | 13-678-27E | Individually wrapped |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430052 | Polypropylene |
| Cryogenic vials | Nalge Nunc international | 5000-1020 | 1.5 mL capacity |
| Freezing container | Nalge Nunc international | 5100-0001 | Mr. Frosty” |
References
- Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. , 5th edition, Wiley-Liss. (2005).
- Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
