Summary
James Thomson ve ark, 1998 yılında kültür embriyonik kök izole etmek ve büyümek için bir teknik geliştirdi beri, daha sonra kullanmak üzere hücreleri donmuş bir stok eritme ve genişleyen donma hücreleri rutin embriyonik kök hücre kültürü yapılan önemli işlemler haline gelmiştir. Embriyonik kök hücreleri dondurma ve çözme streslere karşı çok hassas olduğundan, özel dikkat gerekir. Burada embriyonik kök hücrelerin hızla sıvı azot stokları eritme fare embriyonik besleyici hücreler kaplama ve yavaş yavaş onları uzun süreli depolama için dondurma için uygun tekniği göstermektedir.
Abstract
James Thomson bu yana
Protocol
1. Çözülme embriyonik kök hücreleri
Ön-deneysel Set-up
- Bir gün önce çözülme embriyonik kök hücreler, plaka MEF kültür ortamı jelatin kaplı 6-iyi doku kültürü plaka (D-MEM bazal orta ile desteklenmiş iyi bir fare embriyonik ışınlanmış fibroblastlar (MEF), CF1 gerginlik, bir besleyici tabaka % 10 ısı ile inaktive edilmiş% 1 FBS ve non-esansiyel amino asitler). 37 ° ° C ve% 5 CO 2 gece inkübe.
- Embriyonik kök hücrelerin sıvı azot çıkarmadan önce, gerekli tüm ekipman ve reaktifler yerinde olduğundan emin ve etkili ve başarılı bir çözülme sağlamak için kullanıma hazır.
Embriyonik kök Hücreler Çözülme
- Metal forseps kullanarak sıvı azot depolama tankı, embriyonik kök hücrelerinin kriyojenik flakon çıkarın.
- Don kaldırmak için 3-5 saniye flakon eldivenli eller arasında yuvarlayın.
- Flakonun etiket bilgileri kaydedin.
- Metal forseps kullanarak, flakon 37 ° C su banyosu içine batırın. Swirl hafifçe şişe ve flakon buz kristal hallerini görmek için ışığa doğru tutarak (ama çabuk!) Genellikle çözülme ilerlemesini gözlemlemek. Batığın su banyosu Şişenin kapağı bu hücreler kontamine edebilecek gibi değil.
- sadece küçük bir buz kristali kalır, batığın etanol içinde sterilize etmek için tüm flakon.
- Steril bir biyolojik güvenlik kabini, 15 ml konik bir tüp alt doğrudan kriyojenik flakon içeriğini aktarmak.
- Yavaşça 4 mL embriyonik kök hücre kültürü orta (D-MEM/F-12 bazal orta,% 20 Nakavt serum değiştirme,% 1 non-esansiyel amino asitler,% 1 L-glutamin,% 0.2 beta-mercaptoethanol ve 4 ng / ile desteklenmiş ekleyin mL tüp bFGF). Yeni orta tüp olarak hücrelerin sürekli karıştırmak için hafifçe sallayın.
- 5 dakika için 200 x g. hücreleri Santrifüj
Embriyonik kök Hücreler Kaplama
- Hücre hattı, geçiş numarası ve çözülme tarihi: embriyonik kök hücreler santrifüj iken, uygun embriyonik kök hücre bilgi etiketleme ile MEF besleyici plaka hazırlamak.
- Yaklaşık 2 dakika spin zaman sol olduğunda, MEF kültür ortamı aspirat ve kuyu için 1.0 mL PBS ekleyin.
- Pelet embriyonik kök hücrelerinin biyolojik güvenlik kabini geri getirin, ve süpernatant dikkatlice aspire. Bu çözüm, donma orta DMSO içerdiği için, hücre pelletini aspirat, ama mümkün olduğunca çok süpernatant kaldırmak için değil dikkatli olun.
- Pelet 5 ml damlalıklı cam kullanılarak, embriyonik kök hücre kültür ortamı 2.5 mL ekleme ve 3-4 kez pipetleme çok nazikçe yeniden askıya.
- MEF besleyici PBS aspire edin ve yavaş yavaş 6-plaka iyi hazırlanan embriyonik kök hücre süspansiyonu tüm 2.5 ml ekleyin.
- Plaka 37 ° C inkübatör içine yerleştirin ve dikkatle kuyu boyunca hücreler eşit olarak dağıtmak için ileri geri plaka ve yan tarafına kaydırın. Girdap merkezinde koloniler konsantre önlemek için dairesel bir desen plaka etmeyin.
- Hücrelerin bir gecede 37 ° C ve% 5 CO 2 takmak için izin verin.
- Gün sonra çözülme, orta kaldırmak (kayan hücreleri) ve kuyu için 2.5 ml taze embriyonik kök hücre kültür ortamı ekleyin.
- İsteğe Bağlı: kaldırılır orta ve hücreler ayrı hazırlanan MEF besleyici plaka transfer edilebilir. Bu adım, genellikle orijinal çözülme hücreleri ile paralel olarak kültüre yeni koloniler üretir.
- 37 · C ve% 5 CO 2 gecede plakaları inkübe edin.
2. Embriyonik kök Hücreler Donma
- Embriyonik kök hücreler santrifüj olsa da, hücre hattı, geçiş numarası ve donma tarih de dahil olmak üzere, biyolojik güvenlik kabini içinde kriyojenik şişeleri, etiket. Dondurma embriyonik kök hücreler için tipik yoğunluk kriyojenik flakon başına hücreleri (6 plaka) biridir.
- Embriyonik kök hücreler santrifüj bittiğinde, biyolojik güvenlik kabini tüpleri geri getirmek. Gevşek paketlenmiş hücre pelletini rahatsız etmemek için dikkatli olmak süpernatantı tüpünden aspire edin.
- Kriyojenik flakon başına 0.5 ml embriyonik kök hücre kültür ortamı: embriyonik kök hücre kültür ortamı uygun miktarda hücre pelletini tekrar. Nispeten büyük koloni adet dondurulmuş embriyonik kök hücrelerin daha iyi kurtarmak gibi, pipetleme çok nazik olun.
- Yavaşça, tüp hafifçe sallayarak ederken, hücrelere 2X embriyonik kök hücre dondurma orta (% 60 tanımlanan FBS,% 20 embriyonik kök hücre kültürü orta ve% 20 DMSO) uygun miktarda (cryovial ortalama 0.5 ml) ekleyebilirsiniz. Donma orta pipetlemeyin karıştırmak için 1-2 kere son derece nazik, çözüm eklenir.
- Hızlı fakat nazikçe hücre süspansiyonu, her kriyojenik flakon 1 ml ekleyin.
- Izopropanol dondurma kabı ve yeri içine şişeleri transfergece -80 ° C derin dondurucu. Hücreleri 1 ° C izopropanol dondurma kabı dakikada donar.
- Ertesi gün, sıvı azot depolama tankı metal forseps kullanarak hızla dondurulmuş şişeleri transfer.
Temsilcisi Sonuçlar
Insan ES hücrelerinin çözülmüş ilk günün ardından, küçük koloniler şeffaf görünebilir ve mikroskop altında görmek zor olabilir. Yeni çözülmüş ES hücrelerinin yavaş yavaş çoğalırlar eğilimindedir yılından bu yana kurulan koloniler (Şekil 1) olarak görünmesi için birkaç gün sürebilir.
Şekil 1. Hücre iyileşme ve büyümeyi embriyonik kök hücrelerin, sıvı azot çözülmüş görüntülenmiştir 1, 7 ve 11 gün çözülme sonra.
Discussion
Ekteki video, embriyonik kök hücreler ve donma çözülme için bir yöntem gösteriyor. Mümkün olan en iyi kurtarma sıvı nitrojen içinde dondurulmuş hücreler elde etmek için mümkün olan en kısa sürede banyo çözdürülmelidir. Çözülme hücreleri pipetleme sırasında son derece dikkatli olmayı unutmayın: hücrelerin işlemeyi en aza indirmek ve yavaşça pipetle. Embriyonik kök hücrelerinin Bir flakon, 6-iyi bir plaka, ya da 4-plaka tüm kuyuları birini üzerine kaplama ve hemen inkübatöre yerleştirilir. Dört ayrı kuyu kültür kirliliğine karşı tüm kültür kaybetme olasılığını azaltır ve daha kolay, küçük bir yüzey alanı üzerinde embriyonik kök hücre kolonileri bulmak için yapar bu yana ilk kez embriyonik kök hücreleri çözülme, 4-plaka önerilir.
Embriyonik kök hücreleri çözülme sonra ilk gün, koloniler küçük ve şeffaf olabilir. Kurulan koloniler olarak görünür, embriyonik kök hücrelerin kültür birkaç gün sürebilir kolonileri mikroskop altında belirgin olmasa bile her gün, embriyonik kök hücre kültür ortamı yenileyin. Koloniler genellikle uygun bir boyut çözülme sonra 10 12 gün kadar Pasajlanması için ulaşamadığı gibi, taze kaplama MEF besleyici tabaka hücreleri çözülme kullanmak önemlidir.
Embriyonik kök hücreleri düşük bir geçit flakon çözülme, bir hisse senedi, gelecekteki kültür ve deneyler için düşük geçiş hücreleri korumak için ek şişeleri genişletmek ve dondurmak için iyi bir uygulamadır . Ayrıca rutin olarak dondurulmuş stoklarını korumak için tüm "ekstra" sağlıklı embriyonik kök hücreleri dondurmak için iyi bir fikirdir. En başarılı çözülür ve daha sonraki kültürlerin yüksek kaliteli, farklılaşmamış, bölünen embriyonik kök hücre kolonileri olarak donduruldu. embriyonik kök hücrelerinin büyük bir hücre agrega olarak hafifçe kullanılırsa daha verimli bir dondurma kurtarmak. Son agrega boyutu, rutin bir geçit sonra kaplama agrega boyutu (veya biraz daha büyük) benzer olmalıdır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM | Invitrogen | 11965-092 | For MEF mediumjavascript:void(0); |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Certified | Invitrogen | 16000-044 | Heat-inactivated For MEF medium |
| D-MEM/F-12 | Invitrogen | 11330-057 | |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | Pre-screen to ensure support of hES cells |
| bFGF | Stemgent | 03-0002 | Use at [4 ng/mL] final |
| Non-essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-050 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 200 mM (100X) Use at [1X] final |
| PBS | Invitrogen | 14190-250 | Without Ca2+ or Mg2+ |
| Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12 |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | Type A, Porcine |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2560 | For freezing medium |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Defined | Hyclone | SH300.70.01 | For freezing medium |
| 6-well plates | Nalge Nunc international | 140675 | For general culture |
| 4-well plates | Nalge Nunc international | 176740 | For thawing |
| 5 mL glass pipettes | Fisher Scientific | 13-678-27E | Individually wrapped |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430052 | Polypropylene |
| Cryogenic vials | Nalge Nunc international | 5000-1020 | 1.5 mL capacity |
| Freezing container | Nalge Nunc international | 5100-0001 | Mr. Frosty” |
References
- Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. , 5th edition, Wiley-Liss. (2005).
- Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
