Isolatie en transplantatie van hematopoietische stamcellen (HSC)

Summary

Protocol

Totaal beenmerg voorbereiding

1. Vier B6 muizen worden opgeofferd en ontleed om dij-, scheen-, heup en de wervelkolom te verkrijgen.
2. Tijdens de dissecties, zijn de ledematen en de beenderen bewaard in PBS 2% FCS hitte geïnactiveerd (optioneel 2 mM EDA - dissectie medium).
3. De schone botten zijn gebroken met mortier en een stamper in dissectie medium. Een efficiënte manier om dit te doen is om dij, bovenbenen en heupen van elke muis, vervolgens 2 stekels breken op een moment.
4. De cel mengsel verkregen uit elke muis is gescheiden en gefilterd door een 40μm filter in een 50 ml falcon buis. Op deze manier elke buis bevat de cel mengsel verkregen uit alle botten van een muis, en de helft van het mengsel verkregen van twee stekels. In dit stadium is het filter gebruikt om het bot puin te scheiden.
5. Het is meestal aan te raden om het been botten breken twee keer naar wit te krijgen (zonder beenmerg) botfragmenten, en de wervelkolom fragmenten 2 of 3 keer.
6. Vul de buizen om ze evenwichtig, en spin 5 min. 1200rpm.
7. Zuig het supernatant en los de pellet door het slepen van de buizen op de buis rek (deze stap is belangrijk na elke centrifugering te klonteren vorming en cel-verlies te minimaliseren). Resuspendeer elk buisje in 1 ml PBS 2% FCS (NO EDTA vanaf nu) als je aan het doen afkomst uitputting, of in welke volume is anders handig voor je.

Lineage uitputting

1. Deze procedure stelt u in staat om zeer gedifferentieerde cellen te elimineren en een zeer heterogene populatie van cellen te verkrijgen, verrijkt voor stamcellen en progenitorcellen. Als u het sorteren van HSC, deze stap vermindert drastisch het aantal cellen die moeten gaan door de cel het sorteren, dus vermindering van het sorteren van de tijd en waarmee u HSC uitzoeken van een groter aantal muizen, zodat u kunt een hoger aantal te verkrijgen HSC in een enkele sortering.
2. Als u later gaat sorteren, nemen 50μl van cel mengsel (ik meestal een beetje te nemen van elk buisje) voor het sorteren van controles (ongekleurd en Sca1, c-Kit, CD48, Flk2 enkele kleur controles).
3. Voeg Lin cocktail 30ml/tube. Lineage cocktail bevat een verscheidenheid van antilichamen, die helaas een beetje verandert van lab tot lab. In de Scadden lab gebruiken we biotinilated antistoffen tegen Gr1, Ter119, CD4, CD8, CD3, B220. Hun uiteindelijke verdunning in de kleuring is 1:700.
4. Vortex snel te mengen, en incubeer gedurende 15 min bij 4 ° C.
5. Tijdens de incubatie, de voorbereiding van de kolommen op de magneten en 15ml elutiebuisjes onder de kolommen. Degas sommige PBS met behulp van een steriflip filter (je moet zien wat luchtbellen in de richting van de oppervlakte van de PBS als gevolg van vacuüm aspiratie), en evenwicht de kolommen door de toepassing van 3 ml ontgast PBS aan elke kolom.
6. De kolom stroom is ongeveer 1ml/5min, dus het duurt ongeveer 15 minuten om de kolommen klaar voor gebruik.
7. Aan het eind van de incubatie, voeg PBS 2% FCS om de buizen te vullen en naar beneden draaien gedurende 5 minuten bij 1200.
8. Zuig het supernatant, los van de pellets en resuspendeer in 1 ml / tube ontgast PBS.
9. Als u later het sorteren, nemen in totaal beenmerg Lineage enkele kleur vlekken ctrl (15ml, een beetje van elk buisje).
10. Voeg streptavidine kralen 30ml/tube, vortex snel te mengen, en gedurende 15 min bij 4 ° C. incubeer
11. Aan het eind van de incubatie, voeg 2 ml / buis van ontgast PBS. Plaats nieuwe collectie buizen die onder de kolommen, en passen alle vering om een ​​kolom, filtreren door een filter 40μm.
12. Voeg nog een 3 ml ontgast PBS aan elke buis om het te wassen. Zodra de kolommen zijn leeg, gelden opnieuw met dezelfde 40μm filter.
13. Het eluaat bevat de lijn uitgeput cel mengsel, een heterogene populatie verrijkt stamcellen en stamcellen. Pool de inhoud van de vier buizen in twee buizen. Spin gedurende 5 min bij 1500 tpm.
14. Aspireren supernatant. De pellet moet wit of overwegend wit. Maak de pellets en resuspendeer ze samen in 1 ml PBS totaal 2% FCS als je later sorteren, anders opnieuw in suspensie in welke volume is handig voor je.

LKS of lange termijn HSC sorteren

1. Haal afstamming uitgeput enkele kleur vlekken ctrl (15ml). Dit zal u toelaten om de efficiëntie van uw geslacht uitputting te beoordelen.
2. De cel mengsel te sorteren is gekleurd in de 15 ml buis.

Voeg antilichamen:

Sca PE-Cy5.5	1: 100	10ml
Kit APC	1:100	10ml
SA PE-Cy7	1:500	2ml

Om te sorteren op lange termijn HSC, ook toe te voegen:

CD48 FITC	1:1000	1ml
Flk2 PE	1:200	5ml

Ook bereiden enkele vlekken controles met behulp van het totale beenmerg opzij gehouden na de dissectie en de totale beenmerg afkomst gekleurd. Deze kleuringen kunnen direct worden gedaan in de FACS buizen.

Zorg ervoor dat u in het donker!

1. Vortex snel te mengen en incuberen bij 4 ° C gedurende 20 tot 30 minuten, re-mixen halverwege.
2. Weg te wassen de overmaat van antilichamen, vullen de buisjes met PBS 2% FCS en spin gedurende 5 minuten bij 1500 rpm.
3. Supernatant verwijderen, resuspendeer alle pellets en verplaats ze naar nieuwe FACS buizen met filter caps. Het kan een tijdje duren om de cellen te krijgen om door deze filters, en het is belangrijk om wat meer PBS daarna van toepassing zijn op het filter te wassen en cel verlies te minimaliseren. Deze stap is nodig om te voorkomen verstopping van de sorter, dat is de ergste nachtmerrie van elke cel sorter gebruiker.
4. Bij het uitdelen van je cellen naar de cel sorteercentrum, zorg ervoor om een ​​buis ook te bereiden met PBS 10% HI FCS waar de cellen zullen worden verzameld.
5. Als u sorteren LKS cellen, krijgt u een heterogene bevolking met de lange termijn en korte termijn herbevolking HSC en multipotente voorlopercellen. Een gemiddelde opbrengst is 300.000 LKS van 4 muizen.
6. Als u ook gebruikt CD48 en Flk2 antilichamen, kunt u de afzonderlijke elke populatie op de lange termijn HSC, op korte termijn HSC en MPP. LT-HSC zijn de meest zeldzame bevolking. Een gemiddelde opbrengst is ongeveer 50.000 tot 60.000 cellen van 4 muizen.