Summary
Processen för electrospinning polymerer för vävnadsteknik och cellodling behandlas i denna artikel. Närmare bestämt är det electrospinning av fotoreaktiva macromers med ytterligare bearbetning kapacitet photopatterning och multi-polymer electrospinning beskrivs.
Abstract
Eftersom området tissue engineering utvecklas, det finns en enorm efterfrågan att producera mer lämpliga material och tekniker bearbetning för att hantera de krav (t.ex. mekanik och vaskularitet) av mer intrikata organ och vävnader. Electrospinning är en populär teknik för att skapa fibrösa byggnadsställningar som efterliknar arkitektur och storlekstabellen av de infödda extracellulära matrisen. Dessa fibrösa ställningar är också användbart som underlag cellodling eftersom fibrerna kan användas för att direkt cellulära beteende, inklusive stamceller differentiering (se omfattande recensioner av Mauck
Protocol
A. enda polymer electrospinning
- Innan förbereda electrospinning lösningen, gör en 0,5-lösning wt% av fotoinitiator, Irgacure 2959 (I2959), i avjoniserat vatten genom att lösa vid 37 ° C i flera dagar. Detta steg är inte nödvändigt om en fotoreaktiva polymeren inte används.
- Kombinera methacrylated hyaluronsyra (MEHA, se Burdick et al. För syntes), poly (etylenoxid) (PEO, 900 kDa) och I2959 i avjoniserat vatten för att förbereda en lösning med en slutlig koncentration av 2 wt% MEHA, 3 vikt% PEO och 0,05 vikt% I2959. Använd en virvel så att lösningen blandas tills det är klart. Polymer typ och koncentration, liksom de lösningsmedel som används kan ändras på detta steg beroende på önskad schavotten egenskaper.
- Överför lösningen till en spruta och bifoga en 18 gauge, 6 tum lång, trubbiga änden nål till slutet.
- Programmera en sprutpump för att mata ut med en hastighet av 1,2 ml / timme. Sätt i sprutan och nålen i enheten.
- Fäst jordad ledning av en högspänningsledning källa till samlingen apparaten. Att samla in slumpmässigt fördelade fibrer används en plan metallplatta, eller använda ett dorn roterar med ~ 10 m / s för att samla anpassad fibrer. Fäst positivt laddade leda till nålen. Se figur 1 för en schematisk av electrospinning apparaten.
- Justera nål eller lövuppsamlarens, så att det finns en 15 cm avstånd mellan de två.
- Starta flödet på sprutpump. När vätska visualiseras på nålspetsen, slå på strömkällan och ställ in spänningen till 22 kV.
- Efter samlingen är komplett (från flera minuter för tunna filmer, till upp till 24 timmar för en tjockare matta), ta bort ställningen från insamling apparaten och förvara den under vakuum över natten för att säkerställa fullständig borttagning av lösningsmedel.
- Visualisera fibern morfologi med hjälp av svepelektronmikroskop (SEM) är ett representativt klätterställning visas i figur 1 för både linje och alliansfria strukturer.
Observera: Provet flöde, avstånd till samlingen enheten, och spänningen är beroende av polymer och vätska kombination och måste optimeras för varje system, vanligen genom att observera ställningen morfologi med SEM.
B. Photocrosslinking och Photopatterning
- Skär ut 5 mm x 5 mm prover från schavotten mattan.
- Förbered för crosslinking genom att placera varje klätterställning på en folie täckt glasskiva, placera fotomasken direkt på ställningen, som täcker med en ren glasskiva och klippning båda ändarna med bindemedel klipp. Obs: fyra prover kan göras på en gång, och en öppenhet utan ett mönster kan användas för crosslinking om ett mönster inte är önskvärt.
- Rensa byggnadsställning inrättades en kväve kammare. Det är viktigt att hålla konstruera fri från syre, vilket kan hämma crosslinking.
- Placera byggnadsställning setup i kväve kammare under ~ 10 mW / cm 2 365 nm ljus med en kollimerande adapter för 5 minuter. Se schemat i figur 2.
- Ta bort varje byggnadsställning och placera i en 12 brunnar.
- Tillsätt 2 ml avjoniserat vatten i varje brunn, parafilm plattan för att förhindra avdunstning av vatten och placera vid 37 ° C i 24 timmar. Byt vatten tre gånger.
- Visualisera porbildning i ljusmikroskop (se exempel i Figur 2). De byggnadsställningar är nu redo för användning.
Obs: Photocrosslinking är inte nödvändigt för många typer av polymerer kan dock photopatterning bara användas med fotoreaktiva polymerer.
C. Dubbla Polymer electrospinning med fluorescerande Fiber Visualisering
- Bered en 5-lösning wt% av PEO (200 kDa) i 90% etanol. Rör vid 700 rpm vid 50 ° C i minst 2 timmar före electrospinning.
- Överför PEO lösning till en spruta och lägga DAPI för en slutlig koncentration på 10 mg / ml koncentration i electrospinning lösningen. Linda sprutan i aluminiumfolie för att skydda den mot ljus.
- Förbered samma lösning som beskrivs i steg A2, utom också tillägga methacryloxyethyl thiocarbamoyl Rhodamine B (MeRho, 683,24 g / mol) för en slutlig koncentration av 25 mikroM i electrospinning lösningen. Linda sprutan i aluminiumfolie för att skydda den mot ljus.
- Försiktigt använda tejp för att säkra methacrylated glas täckglas (se Khademhosseini et al.) På ytan av dornen. Notera: fibrer blir bundna till methacrylated glas täckglas.
- Fäst ena änden av en 5 mm lång bit silikonslang med Luer Lock bilagor till en av sprutor och fäst den andra änden till en nål. Sätt in sprutan i pumpen och sätter nålen genom hålet i bonden. Upprepa med den andra sprutan och bonden på motsatt sida av dorn. Den fanners översätta length av dorn och används för att säkerställa en jämn fördelning av både polymerer i den resulterande schavotten. Se schemat i figur 3.
- Justera parametrarna som beskrivs i avsnitt A lämpligt enligt tabell 1. Se till att nålen tips centrerad på dorn.
Tabell 1. Dubbla Polymer electrospinning ParametrarSpruta Bonden att nålspetsen (cm) Nålspetsen till dorn (cm) Flöde (ml / timme) Pålagd spänning (kV) MEHA 6 15 1,2 22 PEO 6 10 1,2 15 - När allt är rätt placerad, stänga av lampor och slå på dornen och pumparna sprutan. Ta bort aluminiumfolie från sprutor. När vätskan är synlig på tips av både barr, samtidigt slå på nätaggregat och koppla in fanners.
- När insamlingen är klar, slå av strömförsörjning och dorn och dra ur fanners. Ta försiktigt bort täckglas och band med ett rakblad.
- Visualisera fibrerna med hjälp av en fluorescerande mikroskop utrustat med filter för Rhodamine och DAPI. Se exempel i figur 3. OBS: fluorescerande fibrer är mest tydlig för att se när electrospun för kortare perioder (<3 minuter), kan dock denna process förlängas en obegränsad tid för att skapa tjockare konstruktioner, speciellt utan användning av glaset täckglasen .
D. Sådd Celler på Ställningar
- Placera varje täckglas med electrospun polymer ansluten till en enskild brunn på en lämplig storlek och platta. Obs: cellulära interaktioner med fibrerna är lätt synliga genom electrospinning på methacrylated glas täckglas. Dessutom kan MeRho återigen användas för fiber visualisering.
- Inkubera ställningar i PBS över natten för att säkerställa fullständig borttagning av lösningsmedel och eventuella lakbara biprodukter.
- Ta bort PBS från brunnarna.
- Att sterilisera byggnadsställningar, placera dem under ett bakteriedödande lampa i ett laminärt flöde huva i 30 minuter. Om en fullständig klätterställning är seedade, vänd ställningen över och placera i en bakteriedödande lampa i ytterligare 30 minuter.
- Utför standard cellodling och förbereda en koncentrerad cellsuspensionen på önskad celltäthet (t.ex. 6000 celler cm -2). Använd till exempel en 100 ml cellsuspension för ett 22 mm x 22 mm täckglas. Placera i inkubatorn i 1 timme.
- Tillsätt lämplig mängd medier cellodling i varje brunn. Placera byggnadsställningar tillbaka in i inkubatorn.
- Färga cellerna med ett kommersiellt tillgängligt Live / Dead kit. Obs: andra typer av celler färgning, såsom DAPI (cellkärnor) och fluorescerande phalloidin (aktin stressen fibrer) kan tillämpas för att visualisera celler.
- Visualisera celler och fibrer med hjälp av en fluorescerande mikroskop utrustat med filter för TRITC och FITC. Se exempel i Figur 4.
Representativa resultat:
Figur 1. Schematisk illustrerar enhetens inställning för alliansfria schavotten bildning (överst) och anpassas klätterställning bildning (botten). Exempel svepelektronmikroskopi bilder av varje typ av byggnadsställning visas. Skala bar = 5μm. Vänligen klicka här för att se en större version av figur 1.
Figur 2. Schematisk för mönstring metod. Mönster bildas genom att placera en fotomask mellan ljuskällan och schavotten under photocrosslinking och sedan tvätta bort oreagerad polymer. Fotomasker och SEM-bild av byggnadsställningar efter porbildning och frystorkning. Skala bar = 100 ìm. Vänligen klicka här för att se en större version av figur 2.
Figur 3 Schematisk av Multi-polymer electrospinning installation och nödvändiga parametrar bearbetning, samt en representant fluorescerande bild av en blandning av två fibrer populationer (exempel: rött MEHA och blå PEO). Som samtidigt electrospun att bilda en multi-polymer byggnadsställning . Skala bar = 100 ìm. Vänligen klicka här för att se en större Version av figur 3.
Figur 4. Ett exempel Live / Dead färgning bild av mänskliga mesenkymala stamceller och deras interaktion med den electrospun fibrer. Skala bar = 100 ìm. Vänligen klicka här för att se en större version av figur 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Electrospinning användes för att förbereda fibrösa ställningar från polymerer. Photocrosslinkable ställningar baserade på hyaluronsyra har använts som ett belysande exempel, där ljusexponering behövs för crosslinking. Med hjälp av reaktiva macromers, såsom MEHA var kanaler som tidigare har visat förbättrad cellulära distributionen införlivas i ställningar med hjälp av en mask under photocrosslinking att bilda makro och mikro-porös ställningar. Dessutom har två olika polymerer electrospun samtidigt med våra egna apparater. Förekomst av två olika fibrer populationer har kontrollerats med tillägg av en fluorescerande färg till varje electrospinning lösning, som senare visas med ett fluorescerande mikroskop. Multi-polymer ställningar kan användas för att förbättra cellulära distributionen, liksom bättre stämma mekanik och nedbrytning av en byggnadsställning för en viss tillämpning i förhållande till enda polymer electrospun ställningar. Dessutom har sterilisering och cell sådd av byggnadsställningar visats. Många av dessa tekniker är mångsidiga och kan användas för en rad olika polymerer för att tillverka olika ställningar för applikationer inom tissue engineering och för odling av celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett American Heart Association Predoctoral Fellowship till JLI och National Institutes of Heath bidrag R01AR056624.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| DAPI | Reagent | Invitrogen | D1306 | |
| I2959 | Reagent | Ciba Specialty Chemicals | ||
| PEO 200 kDa | Polysciences, Inc. | 17503 | ||
| PEO 900 kDa | Reagent | Sigma-Aldrich | 189456 | |
| Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B | Reagent | Polysciences, Inc. | 23591-100 | Prepare stock solution in DMSO |
| Live/Dead Stain Kit | Reagent | Invitrogen | L3224 | Contains Calcein (stains live cells green) and ethidium homodime (stains red dead cells) |
| Syringe Pump | Equipment | KD Scientific | KDS100 | Two are needed for dual polymer spinning |
| Power Source | Equipment | Gamma High Voltage | ES30P-5W | Two are needed for dual polymer spinning |
| Motor | Equipment | Triem Electric Motors, Inc | 0132022-15 | Must attach to a custom built mandrel |
| Tachometer | Equipment | Network Tool Warehouse | ESI-330 | Use to monitor mandrel speed |
| Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter | Equipment | EXFO | S1000 | |
| Silicone Tubing | Equipment | McMaster-Carr | 51135K151 | |
| Luer Lock Female Adapter | Equipment | McMaster-Carr | 51525K293 | |
| Luer Lock Male Adapter | Equipment | McMaster-Carr | 51525K143 | |
| Needles | Equipment | Fisher Scientific | 14-825-16H | |
| Coverslips | Equipment | Corning | 2875-22 |
References
- Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolf, M. A., Langer, R. Controlled degradation and mechanical behavior of photopolymerized hyaluronic acid networks. Biomacromolecules. 6, 386-391 (2005).
- Baker, B. M., Gee, A. O., Metter, R. B., Nathan, A. S., Marklein, R. A., Burdick, J. A., Mauck, L. R. The potential to improve cell infiltration in composite fiber-aligned electrospun scaffolds by the selective removal of sacrificial fibers. Biomaterials. 29, 2348-2358 (2008).
- Ifkovits, J. L., Burdick, J. A. Review: Photopolymerizable and degradable biomaterials for tissue engineering applications. Tissue Engineering. 13, 2369-2385 (2007).
- Khademhosseini, A., Eng, G., Yeh, J., Fukuda, J., Blumling, J., Langer, R., Burdick, J. A. Micromolding of photocrosslinkable hyaluronic acid for cell encapsulation and entrapment. J. Biomed Mater Res A. 79A, 522-532 (2006).
- Mauck, R. L., Baker, B. M., Nerurkar, N. L., Burdick, J. A., Li, W. J., Tuan, R. S., Elliott, D. M., M, D. Engineering on the Straight and Narrow: The Mechanics of Nanofibrous Assemblies for Fiber-Reinforced Tissue Regeneration. Tissue Engineering B. 15, 171-193 (2009).
- Sill, T. J., Von Recum, H. avon Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).
- Sundararaghavan, H. G., Metter, R. B., Burdick, J. A. Electrospun fibrous scaffolds with multi-scale and photopatterned porosity. , Forthcoming (2009).
