Não invasivo In Vivo Pequenos Animais MRI e MRS: Basic procedimentos experimentais

Summary

Este trabalho descreve os procedimentos básicos de pequenos animais não-invasivo de MRI e MRS

Abstract

Pequenos animais de pesquisa Ressonância Magnética (RM) tem emergido como um elemento importante da pesquisa biomédica moderna, devido à sua natureza não-invasiva ea riqueza de informações biológicas que ele proporciona. MR não exige nenhum tipo de radiação ionizante e não invasiva pode proporcionar maior resolução e melhor relação sinal-ruído em comparação com a tomografia outras modalidades ou espectroscópicas. Neste protocolo, vamos concentrar-nos em pequenos animais ressonância magnética e espectroscopia de MR (MRI / MRS) para adquirir a forma não-invasiva de relaxamento ponderada

Protocol

Parte 1: Segurança Magnet

Ambos MRI e MRS usar um campo magnético forte que exige extrema cautela. Por exemplo, o instrumento T 4.7 que usamos para o presente trabalho tem um campo magnético aproximadamente 90.000 vezes o campo magnético da Terra. O campo magnético de alta está sempre, mesmo quando o scanner MR não está sendo usado. Qualquer objeto metálico que entra em contato com um campo magnético de alta será fortemente e rapidamente atraído pelo ímã. É extremamente perigoso se um sujeito experimental ou operador está localizado no caminho do projétil de um objeto metálico voando para o ímã. Portanto, o pessoal que conduzem experimentos MR deve ser cuidadoso para remover qualquer objeto metálico de suas roupas antes de entrar na proximidade do instrumento e também manter o meio ambiente livre de tais objetos. Informações mais detalhadas sobre segurança ímã aparece na literatura ¹ e a seguinte página: http://www.imrser.org/ . A presença de material metálico não só pode causar o problema de segurança mencionados, mas interfere com os resultados experimentais através da indução de imagem / artefatos espectroscópicas. O presente material metálico perto ou dentro do objeto de imagem pode alterar o campo magnético na vizinhança e assim gerar artefatos nas imagens adquiridas ou ampliar a linha de largura de espectros.

Assim, deixe carteira, chaves, canetas, etc fora do ímã, se você lida com os animais para os procedimentos de MR.

Parte 2: Em Vivo MRI de rato em um ímã Horizontal Bore

Preparação de animais para ressonância magnética

1. Todos os procedimentos animal deve ser aprovado pelo cuidado animal institucional e da comissão de uso (IACUC) antes de executar qualquer tipo de manuseio dos animais.
2. Usamos isoflurano vaporizado para anestesiar animais para experimentos de ressonância magnética. Anestesia dos animais pode ser alcançado por outros anestésicos, como Avertin (2,2,2 tribromoetanol ou TBE) e um coquetel de quetamina e xilazina. Informação sobre a dosagem de cada anestésico é encontrado na Tabela 1.
3. Câmara de uma linha de indução com almofada de apoio de plástico absorvente (pad azul ou chuck). Coloque um mouse (ou vários mouses de multi-imagens do rato) na câmara de indução.
4. Ajuste o medidor de vazão do vaporizador isoflurano 1,5 a 0,8 L / min. Em seguida, ajuste o vaporizador isoflurano a 4% para cerca de 2 3 minutos.
5. Depois de atingir o plano cirúrgico de anestesia (ou seja, sem resposta pitada tep), coloque o mouse sobre um suporte de animais com seu nariz inserido em um cone de nariz (ou máscara). Um limitador de cabeça pode ser usado para imagens de cabeça e um suporte de corpo pode ser usado para imagens de corpo.
6. Detentores de animais são usados ​​para impedir o movimento potencial: há vários tipos de suportes comerciais. Além disso, um titular personalizados podem ser fabricados para acomodar quaisquer requisitos especiais de uma instalação experimental. Para um suporte personalizados, certifique-se de usar apenas material não magnético.
7. Durante o período de imagem, ajuste o medidor de vazão para 0,4 0,8 mL / min e reduzir o vaporizador isoflurano a 1,2% 1.5. O gás expirado proveniente do cone do nariz do rato é coletado por uma bomba e removido em um vácuo in-house.
8. Os olhos do animal será mantido úmido com uma pomada lubrificante ocular estéril. O animal será mantido a 35-37 º C durante o experimento dentro de um sistema de circulação de água quente. Outros tipos de fonte de calor pode ser usado como almofadas de aquecimento e ar quente expelido para a bobina de radiofreqüência (RF).
9. Um sistema de monitoramento de animais está no local para monitorar a temperatura do corpo, a respiração / ciclo cardíaco, e sincronizar a respiração / gating cardíaca com aquisições de imagem.
10. A amostra padrão feito de agarose é colocado ao lado do animal para monitorar a mudança abrupta do sinal. Esta amostra agar padrão é particularmente útil para multi-slice e multi-tempo imagem ponto. Quando uma mudança de sinal inesperado é detectado em uma fatia a partir das imagens adquiridas, a fatia com a mudança de sinal inesperado pode ser eliminada. Além disso, as intensidades seu sinal pode ser ajustada com base na mudança de sinal da amostra-padrão durante a pós-imagem análise.
11. Após a colocação do animal de forma segura e componentes de monitoramento no suporte animal, a posição do detentor de animais no centro de uma bobina de RF.
12. Mover a bobina de RF para a sala de ímã e inserir a bobina de RF para o sistema de circulação de água quente colocada no interior do ímã. A Figura 2 apresenta vários componentes de um scanner de ressonância magnética observada a partir da frente do ímã furo.

Experimento MRI

1. Sintonize a bobina de RF na frequência de ressonância ¹ H e combinar a impedância característica da bobina a 50 Ohm usando o painel de sintonia no scanner MR. Este é conseguir melhores condições de recepção do sinal. Mais humano scanners MRI não requerem um processo separado de sintonia / partida, excetonos procedimentos de MRS.
2. Realizar um processo shimming usando uma seqüência de pulso único. Um sinal de MR depende da homogeneidade de campo magnético ambiental. O processo permite shimming o campo magnético na região de interesse para ser o mais homogêneo possível. Cada scanner MR tem sua própria maneira de realizar o processo de calços, incluindo automático rápido shimming processos tais como o mapa rápido e calços de gradiente.
3. Otimizar o pulso de RF, maximizando um perfil de imagem dimensional. Poderes RF pulso pode ser vestida, mantendo o comprimento do pulso constante e um TR longo o suficiente (atraso reciclar) que é de aproximadamente 3 - 5x o T ₁ de tecido.
4. Adquirir imagens olheiro ao longo de três orientações ortogonais para criar axial, coronal e sagital imagens. Uma sequência rápida aquisição de imagem (ie gradiente eco ou fast spin echo seqüência de imagens) pode ser usado para adquirir as imagens scout. As imagens obtidas serão usadas para planejar imagem real com a determinação de planos de imagem.
5. Alterar a girar seqüência de eco. Selecione os parâmetros seqüência correta: TR (atraso reciclar) deve ser de três a cinco vezes o tecido T ₁ para adquirir imagens totalmente relaxado, como a densidade de prótons ou ₂ T imagens ponderadas. TE (tempo de eco) é a duração de tempo entre o pulso de RF em primeiro lugar e no centro de sinal de eco. Um valor TE podem ser selecionados de acordo com o contraste da imagem, conforme resumido na Tabela 2. A Figura 2 mostra em imagens adquiridas vivo com efeitos de relaxamento diferentes de T _1, T ₂ e T ₂ * para um rato nua com um tumor xenoenxerto em suas costas.
6. T ₂ medições pode ser feito usando multiecho imagem ou imagem echo único com vários valores TE.
7. Após a experiência de MRI / MRS in vivo, os animais devem ser monitorados durante todo o processo de recuperação. Depois de ressonância magnética, os animais serão levados para fora da bobina de RF e monitorados para garantir a recuperação total quando voltou para a jaula. Perda de calor é rápida em ratos anestesiados. Manter os animais quente, cobrindo-os com compressas de gaze ou toalhas e / ou fornecer uma fonte de calor até que os animais são recuperados da anestesia.

Processamento de Imagem

1. Revisão imagens adquiridas no console MR e transferência de dados selecionados para um computador de pós-processamento.
2. Normalmente usamos ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) para análise de imagens. A análise de imagem inclui dimensionamento de imagem / filtragem, cálculos de T _1, T ₂ e difusão, as medições de volume do tumor e segmentação de tumores.

Parte 3. Vivo na MRS para Mouse muscular dos membros posteriores ósseas em um ímã Vertical Bore

Construção de Cuff para induzir isquemia reversível

1. Comece com um pedaço de tubo de PVC que é cerca de 5-7 milímetros de largura, com um ID de 12-15 mm. Perfurar um pequeno buraco na parede desta peça e de discussão.
2. Corte um pedaço de balão por isso é aberto em ambas as extremidades (balões de hélio melhor qualidade de trabalho). Insira este pedaço por pedaço do PVC e enrole a fita de volta e termina em conjunto na parede externa do pedaço de PVC.
3. Use shrink wrap para selar o balão termina ao redor do tubo. Você deve ter um manguito com uma parede externa sólida, e uma parede inflável interior.
4. Cortar uma área de envoltório do psiquiatra e balão ao redor do furo rosqueado, tendo o cuidado de deixar a abundância de material entre o furo ea borda do pedaço de PVC. Tópico um pedaço de 1,5 cm de metais não ferrosos (latão, por exemplo) dentro do buraco no PVC. Isso permite que você inflar o manguito. Selar a área com epóxi 5 minutos.
5. Corrigir esse manguito no lugar ao lado da bobina de RF na sonda MRS e se conectar a um esfigmomanômetro externo.

Monitor de Respiração personalizado

1. Nós usamos um monitor de respiração custom made, que é feito para ser compatível com o espaço restrito e acesso ao furo do ímã. Vários modelos comerciais também estão disponíveis.
2. Amarre um pequeno balão até o final da tubulação resistente trecho alimentado na sonda.
3. Conecte a outra extremidade do tubo a um transdutor de pressão.
4. Certifique-se a linha e balão são livres de bolhas de ar. As bolhas vão atenuar o sinal da compressão do balão causado pelo movimento do corpo do mouse, devido à respiração.

Posicionamento do mouse na MRS Probe

1. Anestesiar o rato com Avertin 5% (0,010 peso corporal ml / g).
2. Depois de atingir o plano cirúrgico de anestesia, posicione o mouse na sonda MRS, colocando o mouse sobre as suas costas com o apoio mouse. Coloque o balão cheio de líquido no lado ventral do rato e seguro em lugar com tiras de suporte mouse.
3. Posição do mouse e apoio do corpo na sonda MRS.
4. Puxe uma hindlimb através do manguito isquêmica e bobina MRS. A perna deve ser centrada na bobina como much possível. Este arranjo permite que o corpo do mouse para ser posicionado horizontalmente em um ímã furo vertical (Figura 3).
5. Fix perna no lugar gravando pé para suporte rígido.
6. Lugar termopar por via subcutânea em hindlimb fora da região amostrada pela bobina.
7. Humedecer os olhos com a pomada de lubrificação dos olhos para evitar os olhos de secagem. Cobrir os olhos do mouse e no rosto para evitar o atrito ou irritação da parede da sonda.
8. Sondas de monitorização outros podem ser adicionados, dependendo das necessidades específicas do experimento.

Criação Experiment MRS

1. Conecte o fluxo de ar ao elemento de aquecimento na sonda MRS.
2. Definir a unidade de controlo variável de temperatura em software VNMR para manter a temperatura da perna a 35-37 ° C.
3. Tune freqüência bobina e impedância de correspondência usando o painel de sintonia no software MRS para ambos ¹ H e ³¹ P ressonâncias.
4. Ajuste shimming circuitos para otimizar a homogeneidade do campo magnético B1 na região de interesse usando ^uma espectroscopia H.
5. Mudar para ³¹ P freqüência para determinar a largura de pulso de RF para produzir máxima do sinal de um decaimento livre (FID) (90 hora °).
6. Coletar sinal de alta para espectros de ruído totalmente relaxado (FRS) para determinar as relações de fosfato inorgânico (P _i) e fosfocreatina (PCr) para ATP, em condições totalmente relaxado. Estes espectros são coletados usando o tempo de 90 ° com o tempo entre as aquisições FID (TR) de cerca de 5x o T ₁ da PCr (20 seg. Às 7 T). Estes serão utilizados para a quantificação dos níveis de PCr e P _i a partir de MR espectros.

Experimento isquêmica

1. A perturbação simples isquêmico permite a determinação de repouso e máxima produção de ATP mitocondrial, medindo mudanças na fosfocreatina durante e imediatamente após a isquemia.
2. Set-up da matriz para coletar espectros múltiplas usando um 45 ° de largura de pulso (ou seja, 0,5 x o 90 ° tempo) e uma TR de 0,5 x o T ₁ (~ 1,5 seg.). Normalmente, recolher 4 FIDs para todos os espectros (número de média (na) = 4 em VNMR software) para uma resolução temporal de cerca de 6 segundos. Esta resolução de tempo é suficiente para determinar com precisão em repouso e máxima produção de ATP mitocondrial.
3. Coletar espectros de repouso por aproximadamente 5 minutos.
4. Induzir isquemia inflando o manguito para 270-300 mmHg por 10-12 minutos.
5. Liberação do manguito e coletar espectros de recuperação por 5 minutos.
6. Remova a sonda do ímã e do rato da sonda. Permitir que o mouse para se recuperar da anestesia em condições adequadas. Experimentos podem ser repetidas nos dias subseqüentes. Após a final espectroscopia experimento músculos da perna do rato são removidos e imediatamente freeze-fixada em líquido N ₂ para a análise das concentrações de ATP por HPLC.

Análise de Dados

1. Os dados são analisados ​​off-line usando um dos vários programas de análise espectral para os espectros de RMN. Nosso laboratório utiliza normalmente se encaixam ao padrão ² e jMRUI (http://www.mrui.uab.es/mrui/mrui_Overview.shtml) para quantificar as áreas de pico.
2. Taxas de decomposição inicial PCr durante a isquemia é uma medida da produção de ATP mitocondrial em condições normóxica como descrito em vários trabalhos ^3-5. Taxas de PCr recuperação pode ser usado para determinar a capacidade máxima de produção de ATP mitocondrial com base na abordagem descrita anteriormente ^4,6.

Figura 1. Na configuração do MRI vivo visto de frente do ímã furo. A configuração inclui uma bobina de RF, o sistema de aquecimento animal (ou sistema de circulação de água quente) e inserir gradiente. Todos estes componentes são inseridos em um ímã horizontal. Água quente é aquecida em um reservatório de água fora da sala de ímã e introduzido no sistema de aquecimento de animais através de um tubo Tygon (fita verde). Depois de circular no cilindro, a água é retirado do sistema de aquecimento de volta para o reservatório de água a ser aquecida. Um tubo de isoflurano e tubo de vácuo são usados ​​para anestesiar ratos durante as experiências de ressonância magnética.

Na figura 2 imagens para um rato vivo nu com tumor xenoenxerto (D282 tumor) em sua parte traseira (seta) com efeitos de relaxamento diferentes:. A. T ₁ pesava imagem (TR / TE = 500/14.2ms). B. T ₂ pesava imagem (TR / TE = 2s/40ms). Tanto T ₁ e T ₂ imagens ponderadas foram adquiridas pela seqüência spin echo. C. T mapa ₂ tratados com 4 conjuntos de imagens adquiridas por diferentesdiferentes valores TE variando de 20 a 80 ms. D. T ₂ * imagem pesados ​​(TR / TE = 180/7.39ms, ângulo de inclinação = 20 graus) adquirida pela seqüência gradiente eco. Campo de visão de 35 x 35 mm ² é para todas as imagens MR.

Figura 3. Ilustração de mouse posicionado no suporte horizontal do corpo com a perna garantidos na bobina de RF.

Figura 4. In vivo ³¹ P espectros através de um ciclo de isquemia reperfusão. Os dados foram coletados em um ímã 7 T verticais furo e da linha ampliada com um filtro de 20 Hz exponencial. TR = 1, na = 4, todos os espectros de 20 são plotados.

Tabela 1. Dosagem de anestésico para mouse MRI / MRS.

Animal Espécies	Anestésico Agente	Dose (Mg / kg para injetáveis)	Rota
Mouse	Gás isoflurano	4,0% por 2-3 min (indução), em seguida, 1,2-1,5% continuamente (manutenção)	Inalado através de cone do nariz
Mouse	Avertin	5%, o peso corporal 10ml/kg	intraperitoneal (IP)
Mouse	Cetamina / Xilazina	100 mg / kg e 10 mg / kg	IP

Tabela 2. Imagem com as ponderações de relaxamento

Ponderação imagem	TR (atraso reciclar)	TE (tempo de eco)
T1	Curto (inferior a T1)	Curto (inferior a T2)
T2	Tempo (3 a 5 vezes T1)	Longo (cerca de T2)
PD (densidade de prótons)	Tempo (3 a 5 vezes T1)	Curto (inferior a T2)

T1: relaxamento spin-lattice (ou relaxamento longitudinal) tempo
T2: relaxamento spin (ou relaxamento transversal) tempo

Discussion

As etapas de pré-aquisição de sintonia / partida e calços são críticos para adquirir alta resolução espacial e uma relação sinal-ruído alto (SNR). Também é importante para monitorar as condições dos animais com um sistema de monitoramento de animais para manter um estado estável fisiológica para os animais durante as aquisições sinal para cumprir com a manipulação de animais sem crueldade e para impedir qualquer potencial artifactual medições. Os procedimentos explicados no protocolo podem ser modificados para adquirir informações adicionais, incluindo perfusão, difusão e fluxo de imagens e espectroscopia localizada in vivo. Todos os preparativos de animais deve ser semelhante a menos que um procedimento requer uma configuração adicional. Os protocolos de MRI e MRS descrito neste estudo têm sido utilizados para várias aplicações, incluindo longitudinal exames de ressonância magnética para o desenvolvimento de nanossondas para alvejar tumores ⁷ e MRS estudos para a produção de ATP mitocondrial ^5,8. MRI e MRS são técnicas úteis para visualizar de forma não invasiva de animais mudança anatômica de relaxamento, ou para monitorar o metabolismo de modo não destrutivo. Ambas as técnicas podem ser utilizadas como procedimentos de acompanhamento longitudinal para examinar acima mencionadas mudanças ao longo do tempo. MRS para nós construímos uma sonda RF personalizado que permite que o animal seja mantido na posição horizontal em um ímã verticais furo. Assim, essas experiências podem ser realizadas em qualquer ímã grande furo vertical, como é encontrado na maioria dos departamentos de química.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inova 200 MR scanner/4.7 T	Varian Inc., Agilent		Used for mouse MRI
Inova 300 NMR spectrometer/7 T	Varian Inc., Agilent		Used for MRS of mouse skeletal muscle