Summary
このビデオはPuraMatrix、ペプチドのゲルを組み立てる市販の自己のがん細胞をカプセル化し、文化に方法を示しています。
Abstract
増加する証拠は、反復する腫瘍生物学の複雑さをより正確に三次元的にその培養癌細胞を示唆している。これらのモデルの多くは、これらの細胞培養モデルの成長に影響を与えることができる成長因子やサイトカインの変数量を含む動物由来の再構成基底膜を利用する。ここで、我々は詳細に説明PuraMatrix、動物由来の材料および卵巣癌細胞株、OVCAR - 5をカプセル化し、伝播する病原体を欠いている市販の自己組み立てペプチドゲルの調製および使用。我々は、使用前にPuraMatrixを準備する方法を説明することから始めます。次に、我々は適切にハイドロゲルに細胞をカプセル化するPuraMatrixと細胞懸濁液を混合する方法を示します。生理的な環境への細胞培養培地または注射を添加すると、PuraMatrixのペプチド成分は急速に自己は、500から200 nmの平均孔径をナノメートルスケールの繊維状の構造を示す3Dハイドロゲルに組み立て
Protocol
テクニカルノート：
- ゲル化は、塩の添加によって開始されます。したがって、ゲル化が望まれるまでには塩がPuraMatrixに接触しないことが重要ですし、非常に低イオン強度の塩（例えば、<0.05 M）への曝露は、不可逆的なゲル化が発生します。
- 用意されている残りの原液は、彼らは塩と接触されていなければ後日使用することができます。あなたは繰り返し超音波処理を心配する必要はありません。
- 気泡を遠心分離に続いて滅菌チューブにPuraMatrixを小分け削除することができます。
- 簡単にPuraMatrixのベッドを混乱させることができる吸引などのメディアの変化時には十分注意してください。
材料：
BD PuraMatrix RAD16のペプチドハイドロゲル1％（カタログ番号354250）：原液混合物の総ペプチドの濃度は10 mg / mlである。
- 水浴ソニケーターまたはボルテックス
- 96ウェル細胞培養ディッシュ
- 細胞培養培地
- 滅菌濾過したH 2 O
- 滅菌濾過した20％ショ糖
- 細胞（全5,000細胞/ウェル）：OVCAR - 5
すべてのステップは、無菌条件下で行う必要があります。
手順：
- 使用前に粘度を減らすために30分間水浴の超音波処理で1％PuraMatrix（RAD16）を超音波で分解する。
- 1％PuraMatrixのソリューションは現在、将来の実験を簡素化するために滅菌チューブに等分することができます。
- 気泡の形成を避け、彼らが形成している場合は単純に5分間1000rpmで（300 × g）でPuraMatrixを含有する滅菌チューブをスピンダウン。
- 原液混合物の総ペプチドの濃度は10 mg / mlである。
- 4ウェルの二組はそれぞれ、2.5 mg / mlの1.25 mg / mlの合計ペプチドの濃度で播種される。
- 10％ショ糖でBD PuraMatrixの2倍の濃度を達成するために、それぞれ、よく0.2μmの5 mg / mlのと2.5 mg / mlの合計ペプチド濃度まで滅菌濾過した20％ショ糖と13.3％のショ糖で設定された各PuraMatrixを希釈する。
- 20％のショ糖を作るために、次にスクロース10gを、50mlの水にボリュームを希釈する。
- 13％、10％ショ糖を20％ストック溶液を希釈することにより調製することができる。
- 13％ショ糖（各10 mlの）：6.5ミリリットル20％ショ糖+ 3.5 mlの滅菌H 2 O
- 10％ショ糖（各10 mlの）：5.0ミリリットル20％ショ糖+ 5.0 mlの滅菌H 2 O
- あなたがプレートにしようと井戸の数に基づいてPuraMatrixペプチドのマスターミックスを調製する。 （下記の例を参照してください。）それからマスターミックスの25mlを含む個々のチューブに分注し。
- マスターミックスは、それがメッキ中に細胞の等体積で希釈されるため、合計ペプチドの倍所望の最終濃度に調製してください。
- マスターミックスは、それがメッキ中に細胞の等体積で希釈されるため、合計ペプチドの倍所望の最終濃度に調製してください。
- 細胞単層培養細胞をトリプシン処理により細胞懸濁液を準備します。
- 0.05％トリプシンEDTA 2mlを各T - 75フラスコに使用することができます。
- 10％の熱不活化ウシ胎児血清を含む細胞培養培地の添加によりトリプシンを中和する（前のステップで使用されるトリプシンのmlあたりのメディアの少なくとも2 mlを使用する。）
- 細胞ペレットを作成するために5分間1000rpmで（〜300 × g）で細胞を遠心分離します。
- 10パーセント滅菌濾過したショ糖で細胞を再懸濁します。
- 細胞をカウントし、メディアに見られる塩の微量を削除するには、5分間で1000rpm（〜300 × g）で再びスピンダウン。
- ウェル当たりの最終細胞数は、各ウェルに5,000細胞になるように2.0 × 10 5細胞/ mlで10％ショ糖でOVCAR - 5細胞を再懸濁します。
次の手順を迅速に実行する必要があります。 - 上記の回路図に示すようにPuraMatrixのマスターミックス25μlを含む最初の個々のチューブに2.0 × 10 5細胞/ mlの懸濁液25μlを追加します。
- すぐに気泡を導入することなく、チューブに（上下〜5回）ピペッティングにより混和する。
- その後96ウェルディッシュの適切なウェルに50μlの細胞懸濁液/ PuraMatrix混合物をピペットで。
- 優しくもの側面に150μlの細胞培養培地（RPMI + 10％FBS）をピペッティングでのBD PuraMatrixのゲル化を開始
- すべての井戸がメッキされるまで、8で説明した手順を繰り返します。
- 30分後に非常に穏やかにハイドロゲルのpHを平衡化するために200μlのピペットを使用して、メディアの〜2 / 3を削除。
- これはマトリックスが中断されます、真空吸引器を使用しないでください
- よくなるようにピペットチップを置きますそれは、PuraMatrixのベッドに触れ、ゆっくりとよくからメディアを削除しません。
- ケアは、PuraMatrixの細胞の培養中に行列を妨害しないように注意してください。
- 非常にゆっくりと PuraMatrix内にカプセル化も含むセルの側面に新たな細胞培養培地150μlを加える。
- 慎重に手順10と11を繰り返すことによって、新鮮な培地で各ウェル毎に48時間の細胞培養培地を変更します。
代表的な結果：
上記のプロトコルで説明したように図1。OVCAR - 5細胞を封入した。画像は、スペクトラフィジックスDeepSeeのチタンを搭載した倒立オリンパスFV1000顕微鏡を用いて取得されました：サファイアレーザーは750 nmのように調整。イメージングセッションは1日目、3、5と7のポスト - メッキに実施された。 40倍対物レンズ（オリンパスLUMPLFLN 0.8 NA）を浸漬長い作動距離、水がPuraMatrixを通してイメージに使用されていました。三次元ボリュームは、1.47μmの軸方向のステップで画像スタックを取得することにより収集した。二つの非デスキャン検出器は紫（440〜490 nm）と緑（510〜550 nm）のバンドパスフィルタを用いて自家蛍光発光を収集した。最終的な画像と深さのスタックムービーは、両方の検出チャネルを組み合わせることで、ImageJを用いて処理した。してくださいここをクリックして図1の拡大バージョンを参照すること。
References
- Gelain, F., Bottai, D., Vescovi, A., Zhang, S. Designer self-assembling Peptide nanofiber scaffolds for adult mouse neural stem cell 3-dimensional cultures. PLoS One. 1, e119-e119 (2006).
