Biology

PuraMatrix Инкапсуляция раковых клеток

Published: December 17, 2009 doi: 10.3791/1692

Adnan O. Abu-Yousif¹, Imran Rizvi^1,2, Conor L. Evans¹, Jonathan P. Celli¹, Tayyaba Hasan^1,3

¹Wellman Center for Photomedicine Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, ²Thayer School of Engineering, Dartmouth College, ³Department of Dermatology, Harvard Medical School

Summary

Это видео демонстрирует, как для инкапсуляции и культуры клеток рака в PuraMatrix, имеющихся в продаже самостоятельно сборки пептидной геля.

Abstract

Увеличение данные свидетельствуют о том, что клетки рака культивирования в трех измерениях более точно повторяет сложности биологии опухоли. Многие из этих моделей используются восстановленные базальной мембраны, полученных от животных, которые содержат различное количество факторов роста и цитокинов, которые могут влиять на рост этих моделях клеточных культур. Здесь мы подробно описывать подготовку и использование PuraMatrix, имеющихся в продаже самостоятельно сборки пептидной гель, который лишен животного происхождения материала и патогенные для инкапсуляции и распространяются клетка рака яичников линии, OVCAR-5. Мы начнем с описания того, как подготовить PuraMatrix перед использованием. Далее, мы показали, как правильно смешивать PuraMatrix и клеточной суспензии для инкапсуляции клеток в гидрогеля. После добавления культуры клеток или инъекции в физиологической среде, пептидные компоненты PuraMatrix быстро самостоятельно собирает в 3D-гидрогель, который показывает волокнистые структуры нанометрового масштаба с средним размером пор 5-200 нм

Protocol

Технические примечания:

Гелеобразование инициируется добавлением соли. Поэтому, очень важно, что ни соли вступают в контакт с PuraMatrix до гелеобразования желательно; воздействия соли очень низкой ионной силы (например, <0,05 М) приведет к необратимым гелеобразования.
Оставшийся запас решений, которые готовы могут быть использованы позднее, если они не вступают в контакт с солями. Вам не нужно беспокоиться о том повторить ультразвуком.
Пузырьки воздуха могут быть удалены aliquoting PuraMatrix в стерильные пробирки с последующим центрифугированием.
Будьте очень осторожны при изменении СМИ как стремление может легко нарушить PuraMatrix постели.

Материалы по теме:

BD PuraMatrix RAD16 пептида Гидрогель-1% (Cat # 354250): общая концентрация пептида неразбавленной смеси составляет 10 мг / мл.

Вода Sonicator Ванная или Vortex
96-луночного блюдо культуре клеток
Медиа культуре клеток
Стерильные Фильтрованный H ₂ O
Стерильные Фильтрованный 20% сахарозы
Cells (всего на 5000 клеток / лунку): OVCAR-5

Все шаги должны быть выполнены в асептических условиях.

Порядок действий:

Разрушать ультразвуком 1% PuraMatrix (RAD16) в sonicator водяной бане в течение 30 минут, чтобы уменьшить вязкость перед использованием.
1% PuraMatrix решения теперь могут быть аликвоты в стерильные пробирки для упрощения будущих экспериментов.
1. Избегайте образования пузырьков воздуха, а если они образуют просто спином вниз стерильные пробирки, содержащие PuraMatrix при 1000 оборотов в минуту (300 мкг) в течение 5 минут.
2. Общей концентрации пептида неразбавленном смеси составляет 10 мг / мл.
Два подхода по 4 скважины будут покрыты в дозе 2,5 мг / мл и 1,25 мг / мл общей концентрации пептида, соответственно.
Развести PuraMatrix в каждой лунке комплекте с 0,2 мкм стерильно фильтруют 20% сахарозы и 13,3% сахарозы к общей пептидной концентрации 5 мг / мл и 2,5 мг / мл, соответственно, для достижения 2x концентрация BD PuraMatrix в 10% сахарозы.
1. Сделать 20% сахарозы, развести 10 г сахарозы, то объем до 50 мл воды.
2. 13% и 10% сахарозы может быть получен путем разбавления 20% маточного раствора.
  1. 13% сахарозы (на каждые 10 мл): 6,5 мл 20% сахарозы + 3,5 мл стерильного H ₂ O.
  2. 10% сахарозы (на каждые 10 мл): 5,0 мл 20% сахарозы + 5,0 мл стерильного H ₂ O.
Подготовка мастер смесь пептидных PuraMatrix в зависимости от количества скважин вы собираетесь пластины. (См. пример ниже). Затем аликвоту в отдельные пробирки с 25 мл мастера микса.
1. Мастер смесь должна быть готова в два раза желаемой конечной концентрации общего пептида, как это будет разбавляют равным объемом клеток в процессе металлизации.
Подготовка клеточные суспензии по trypsinizing культурах клеток монослоя клеток.
1. 2 мл 0,05% трипсина ЭДТА может быть использована для каждого Т-75 Flask.
Нейтрализовать трипсина путем добавления культуры клеток, содержащих 10% тепла инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (использовать не менее 2 мл среды на мл трипсина использовали на предыдущем шаге.)
Центрифуга клетки при 1000 оборотов в минуту (~ 300 мкг) в течение 5 минут, чтобы создать клеточный осадок.
1. Ресуспендируют клеток в 10% стерильно фильтруют сахарозы.
2. Граф клеток и со спином вниз снова при 1000 оборотов в минуту (~ 300 мкг) в течение 5 мин для удаления следовых количеств соли содержится в средствах массовой информации.
Ресуспендируют OVCAR-5 клеток в 10% сахарозы, 2,0 х 10 ⁵ клеток / мл, так что окончательное число клеток на лунку будет 5000 клеток в каждую лунку.

Следующие шаги должны быть выполнены быстро.
Добавьте 25 мкл 2,0 х 10 ⁵ клеток / мл суспензии для первого индивидуального пробирку 25 мкл мастер смесь PuraMatrix, как показано на схеме.
1. Быстро перемешать с помощью пипетки (~ 5 раз вверх и вниз) в трубке без введения пузырьков воздуха.
2. Потом пипеткой 50 мкл суспензии клеток / PuraMatrix смесь в соответствующую лунку 96 и блюда.
3. Инициировать гелеобразования PuraMatrix BD, осторожно пипетки 150 мкл культуры клеток (RPMI + 10% FBS) в сторону хорошо
Повторите действия, описанные в 8, пока все скважины были покрыты.
Через 30 минут очень осторожно удалить ~ 2 / 3 от носителя с помощью 200 мкл пипетки, чтобы уравновесить рН гидрогеля.
1. НЕ ИСПОЛЬЗУЙТЕ Вакуумный аспиратор, так как это нарушает MATRIX
2. Место пипетки в хорошо так, чтобыон не касается PuraMatrix кровать и осторожно извлекайте носитель из колодца.
3. Следует проявлять осторожность, чтобы не нарушить матрицы при культуре клеток в PuraMatrix.
Очень осторожно добавить 150 мкл свежей среды культуры клеток в сторону так, содержащих клетки инкапсулированных в PuraMatrix.
Изменение культуры клеток в каждой лунке каждые 48 часа со свежей культуральной среды, тщательно повторяя шаги 10 и 11.

Представитель Результаты:

Рисунок 1. OVCAR-5 инкапсулированные клетки, как описано в предыдущем протоколе. Изображения были получены с помощью перевернутого Olympus FV1000 микроскоп с Spectra-Physics DeepSee Ti: Sapphire лазера, настроенного на 750 нм. Изображений сессий были проведены в дни 1, 3, 5 и 7 после металлизации. Большое рабочее расстояние, вода погружения 40x цель (Olympus LUMPLFLN 0,8 NA) был использован для изображения через PuraMatrix. Трехмерная объемы были собраны за счет приобретения изображение стеки в 1,47 мкм осевого шага. Два не-descanned детекторов собраны аутофлюоресценция выбросов использованием фиолетового (440-490 нм) и зеленого (510-550 нм) полосового фильтра. Окончательного изображения и глубину стека фильмы были обработаны с использованием ImageJ путем сочетания обоих каналов обнаружения. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 1.