Mozaïek zebravis Transgenese voor het evalueren van Enhancer Sequences

Summary

We tonen onze aanpak voor het vinden van potentiële enhancer elementen uit de op ontwikkelingsgebied gereguleerde genen en evalueren van hun functie door middel van mozaïek zebravis transgenese.

Abstract

De voltooiing van het menselijk genoom sequentie, samen met die van vele andere soorten, heeft gewezen op de uitdaging van het toeschrijven van specifieke functie niet coderende sequenties. Een prominente functie uitgevoerd door de niet-coderende deel van het genoom is te regelen gentranscriptie, maar er zijn geen effectieve methoden om in grote lijnen te voorspellen cis-regulatorische elementen van primaire DNA-sequentie. We hebben een efficiënt protocol om functioneel beoordelen van mogelijke cis-regulatorische elementen door middel van zebravis transgenese. Onze aanpak biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van cel-cultuur op basis van technieken voor ontwikkelings belangrijk genen, want het geeft informatie over de ruimtelijke en temporele genregulatie. Omgekeerd, is het sneller en goedkoper dan vergelijkbare experimenten in transgene muizen, en we routinematig toe te passen op sequenties van het menselijk genoom. Hier laten we zien onze benadering van het selecteren van elementen voor het testen op basis van volgorde behoud en onze protocol voor het klonen van sequenties en microinjecting ze in zebravis embryo's.

Protocol

1. Selectie en klonen van geconserveerde sequenties voor het testen van

1. Men moet eerst identificeren van potentiële regulerende sequenties voor functionele testen. Wij vertrouwen op evolutionaire opeenvolging behoud als een criterium om sequenties te selecteren, en het meest gebruikt het algoritme PhastCons, die toegankelijk is als een track op de UCSC Genome browser (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway). Echter, er zijn vele andere algoritmes beschikbaar om de sequentie van het behoud te evalueren tussen soorten.
2. Zodra we onze reeksen geselecteerd, ontwerpen we primers voor elke sequentie versterken van genomisch DNA. Primers moeten worden geselecteerd om de geconserveerde regio plus 30 of meer baseparen aan beide kanten te versterken.
3. Voor versterking van de geselecteerde sequenties we gebruik van de Takara LA TaqTM systeem. Andere polymerasen zal werken, maar het is belangrijk om een ​​mix die een enzym met proeflezen mogelijkheid is inclusief gebruik, om de kans op fouten die tijdens versterking te minimaliseren. We controleren de amplicongrootte door agarose gelelektroforese.
4. We gebruiken de pCR 8/GW/TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen) om het PCR-product kloon in een entry vector die attL recombinatie sites, op de gateway entry kloon te genereren. Het klonen reactie is efficiënter met verse PCR-product, dus het is het beste om het klonen uit te voeren binnen een dag van de PCR. Transformatie in DH5a stammen wordt uitgevoerd, gevolgd door spectinomycine weerstand selectie.
5. We controleren of het product van de TA klonering door digestie van ~ 500ng van plasmide met EcoRI om de insert release, en bevestig de grootte van de insert door agarose gelelektroforese. We raden sequencing om de volgorde te voegen en de oriëntatie te controleren; primers gebruikt voor de amplificatie kan ook worden gebruikt voor het rangschikken.
6. Vanaf de datum van kloon, is het niet-coderende geconserveerde sequentie geschuif door LR recombinatie naar onze Gateway klaar voor bestemming vector, pGW_cfosGFP1, met behulp van Gateway LR Clonase II enzym Mix (Invitrogen). Transformatie in DH5a stammen wordt uitgevoerd, gevolgd door ampicilline-resistentie selectie.
7. We controleren of het product van de LR recombinatie door digestie van ~ 500ng van plasmide met EcoRV om de insert release, en bevestig de grootte van de insert door agarose gelelektroforese. Zodra een nauwkeurige kloon is geïdentificeerd, bereiden we plasmide DNA met behulp van de Qiagen HiSpeed ​​® Plasmid Midi Kit. We verder zuiveren het plasmide met behulp van de PCR Purification Kit QIAquick, volgens de fabrikant protocollen, en elueer het DNA met 30 pi RNase vrij water. Het plasmide wordt verdund tot een concentratie van 125 ng / ul en bewaard bij 4 ° C voorafgaand aan de injecties.
8. RNA-codering functionele Tol2 transposase enzym is getranscribeerd in vitro van de pDB600 plasmid2. We zuiveren het plasmide met behulp van de Qiagen Midi-Prep kit, dan lineariseren 10-20 ug met Xbal. Het mRNA-synthese wordt uitgevoerd naar aanleiding van de mMESSAGE mMACHINE Kit-protocol (Ambion).
9. We zuiveren en het neerslaan van de RNA volgens de kit instructies. We mengen RNA tot een uiteindelijke concentratie van ~ 1μg/μl, of 20 ul voor een enkele reactie, in het RNase vrij water, en te kwantificeren door UV spectrofotometrie. Analyseren we ook ~ 1μg van RNA door agarosegelelektroforese over de gehele lengte transcriptie te controleren. Hoewel een standaard TAE of TBE gel is voldoende voor deze analyse, moet het denatureren sample buffer die bij de transcriptie kit worden gebruikt volgens de kit instructies.
10. We testen elke nieuwe partij transposase RNA voor effectiviteit door het uitvoeren van injecties met een bekende plasmide (zie figuur 1). Na verificatie, wordt het RNA verdeeld in kleine porties en opgeslagen bij -80 ° C, om herhaalde ontdooien en opnieuw bevriezen van de individuele monsters te voorkomen.
    
    Figuur 1. Zebravis embryo geïnjecteerd met de muis Sox10 enhancer als een controle. (Top) Helderveld beeld (Bottom) GFP fluorescentie beeld. Elke nieuwe partij transposase RNA is getest op werkzaamheid.

2. Micro-injectie van de zebravis embryo's voor mozaïek transgene analyse

1. We trekken de naalden voor de micro-injectie van 1,2 mm OD gloeidraad capillair glas op een Sutter P-97 Micropipet Puller, met een programma dat is ontworpen om een ​​sterke tip met een vrij scherpe kaars aan intacte chorions dringen opleveren. We breken de tips met de hand onder een stereomicroscoop voor een buitendiameter van ongeveer 15 urn, met behulp van een schoon scheermesje en een micrometer. De naalden kunnen worden gemaakt op de dag voor injecties, en opgeslagen in een overdekte holding schotel schoon te houden.
2. Wij handhaven onze zebravis op een regelmatige licht-donker-cyclus, met 14 uur licht, onder normale conditions3. De dag voorafgaand aan het uitvoeren van micro-injecties, zetten we vissen voor de timing van paringen in kleine fokkerij tanks, elk bestaande uit een basislaag tank, een schuimspaan uit de voegen, en een plastic deksel. Plaatsen we drie vrouwtjes of twee mannetjes per tAnk in parallelle rijen.
3. Op de ochtend van de micro-injecties, kort nadat het licht cyclus begint, starten we het combineren van mannen en vrouwen in schoon systeem behandelde water voor de productie van eieren. Het is belangrijk om te controleren op de vis vaak, en het verzamelen van de eieren binnen een paar minuten van de leg, om goed gesynchroniseerd batches te krijgen. Ei-productie kan worden gehandhaafd voor twee tot drie uur, door te blijven verse groepen van vis te combineren in de ochtend.
4. Met een brede boring, 5 1 / 4 "glas Pasteur pipet voorzien van een latex bol, we de verzamelde embryo's te sorteren in 60 x 15 mm petrischaaltjes, gedeeltelijk gevuld met Embryo Medium2, in groepen van 50 embryo's, en geven de tijd verzameld op het deksel van elk gerecht.
5. Zodra de vissen zijn begonnen leggen, bereiden we verse injectie oplossing door het mengen van de volgende in een microfugebuis op ijs:

   Bestanddeel
   Transposon plasmide voorraad (125ng/μl)	1μl
   Transposase RNA voorraad (175ng/μl)	1μl
   Fenolrood voorraad (2% in H 2 O)	0.5μl
   RNase vrij water	2.5μl

   
   De injectie naalden zijn vastgelegd in de holding gerechten en ingevuld door pipetteren 500 nl druppels van de injectie-oplossing op het brede einde van elke naald. Nadat de vloeistof is gevestigd op de punt door middel van capillaire werking, kunnen aanvullende oplossing worden toegevoegd tot een totaal van 1,5-2 pl. We bereiden ten minste twee naalden voor elke oplossing voor injectie.
6. De gevulde naald is geladen in de hand gehouden naald houder van een pneumatische Pico-pomp of een soortgelijke druk injector, geconfigureerd en aangesloten op een N2 tank volgens de instructies van de fabrikant. We kalibreren injectie volumes door het meten van de diameter van de druppeltjes in minerale olie op een micrometer. Meestal zal een injectie van 120 ms met een druk van 20 psi opbrengst een druppel van ongeveer 1 nl, maar lichte variaties in de naald met een diameter is van invloed op deze parameters en herkalibratie kan nodig zijn tussen de naalden.
7. De injecties worden uitgevoerd onder een stereomicroscoop bij 6-10X vergroting. We maken gebruik van een paar van fijne pincetten voor het embryo zijn plaats te houden, druk de injectienaald met constante druk door het chorion en in de dooier van een embryo aan de ene cel of vroeg twee cellig stadium. In het ideale geval hebben we de positie van de naaldpunt in de dooier net onder de blastomeren. Ongeveer 1 nl van de injectie-oplossing wordt uitgestoten en de naald teruggetrokken. Voor elk construct we injecteren ≥ 200 embryo's. Het is ook heel belangrijk, voor elke koppeling van de verkregen embryo's, om op te slaan een schotel van uninjected controle embryo's.
8. Na de injecties zijn afgerond we sorteren de embryo's door het verwijderen van onbevruchte eieren, beschadigde embryo's, en mislukte injecties (embryo's zonder fenolrood in blastomeren). Vervolgens hebben we Incubeer de embryo's in embryo medium bij 28,5 ° C tot het juiste moment voor waarnemingen.

3. Analyse van de mozaïek expressiepatronen

1. Naar aanleiding van een geschikte incubatietijd, onderzoeken we de geïnjecteerde embryo's voor fluorescentie. De timing hangt af van het normale expressiepatroon van de endogene zebravis-gen, maar we meestal kijken dagelijks door de eerste 5 dagen na de bevruchting.
2. We onderzoeken de embryo's voor fluorescentie op een Olympus MVX10 macroscoop uitgerust voor epifluorescentie, maar een soortgelijke microscoop die een laag stroomverbruik imaging zal werken. Als er een groot aantal embryo's dat overleed of ontwikkeld abnormaal in de eerste dagen, kijk naar de uninjected controles voor die koppeling om te zien of ze er normaal. Als de controles er normaal uitzien, het meest voorkomende probleem is onvoldoende zuiverheid van de geïnjecteerde DNA. Ook de embryo's in een vroeg stadium zijn gevoelig voor de totale hoeveelheid ingespoten plasmide, dus het is mogelijk dat de kwantificering onjuist was en te veel DNA werd geïnjecteerd.
3. Bij het onderzoek van de embryo's, in gedachten te houden dat ze allemaal zullen worden mozaïek voor de geïnjecteerde bouwen. Het zal nodig zijn om zorgvuldig te kijken naar alle van de embryo's, vooral als de verwachte domein van expressie klein is. Bedenk ook dat de uitdrukking zou kunnen worden dynamische, sterke fluorescentie op dag 1 kunnen verdwijnen op dag 2, en embryo's negatief voor de expressie van de eerste 3 dagen misschien iets laten zien op dag 4.
4. We kiezen een aantal embryo's met uitgebreidere expressie, en deze gebruiken om het patroon van de fluorescentie door photomicroscopy document. Na 5 dagen van waarnemingen, moet de embryo's worden teruggegeven aan de faciliteit en opgevoed als een voorraad. In een aantal maanden, kunnen de volwassenen worden gescreend op kiembaan overdracht van de transgenen.

4. Resultaten

We zien een grote variety van patronen en het niveau van expressie, afhankelijk van de versterker element wordt geanalyseerd. We zijn meestal geïnteresseerd in zeer weefsel-specifieke expressie patronen, en zijn vaak gericht op genen die, uitgedrukt in het skelet. en zijn vaak gericht op genen die, uitgedrukt in het skelet. Figuur 2 toont voorbeelden van mozaïek expressie patronen hebben we gezien bij onze geïnjecteerd embryo's, met versterkers reguleren van expressie in kraakbeen en bot. Tot slot, een substantieel deel van de geteste sequenties niet reguleren weefsel-specifieke expressie. Voor deze, we meestal zien zeer weinig fluorescentie, misschien een paar losse cellen per embryo. Minder vaak, misschien zien we fluorescentie, maar slechts in twee algemene sites voor ectopische expressie, de opperhuid en de skeletspieren (figuur 3).

Figuur 2. Voorbeeld van kraakbeen en bot expressie waargenomen patronen in de geïnjecteerde embryo's.

Figuur 3. Er is weinig correlatie tussen de locatie van de enhancer ten opzichte van het gen en de regulering van meningsuiting. Een substantieel deel van de geteste sequenties niet reguleren weefsel-specifieke expressie. Deze hebben vaak zeer weinig fluorescentie, of kunnen hebben twee gemeenschappelijke locaties voor ectopische expressie: de opperhuid en de skeletspieren. (Top) Helderveld beeld (Bottom) GFP fluorescentie beeld.

Discussion

We hebben aangetoond dat de aanpak die in ons laboratorium voor de efficiënte analyse van de potentiële versterkers met behulp van zebravis transgenese. Meestal gebruiken we deze benadering te zoeken naar weefsel-specifieke enhancers geassocieerd met menselijke genen. Ondanks het ontbreken van voor de hand liggende sequentiehomologie de meeste van de tijd tussen mens en vis niet-coderende sequenties, vinden we dat deze aanpak succesvol is meestal bij het identificeren van versterkers voor de genen die voor ons van belang. De kritische factoren voor succes zijn de zorg in de voorbereiding van het plasmide DNA en de transposase RNA, en het injecteren van en het onderzoek van een voldoende aantal embryo's voor elk te bouwen. De algemene wijze van transgene bouw, embryo micro-injecties, en mozaïek expressie analyse zou van toepassing zijn op transgene zebravis lijnen voor vele andere doeleinden genereren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Takara LA Taq	Takara Bio Inc	RR02M
pCR8/GW/TOPO TA Cloning Kit	Invitrogen	K2500-20
Gateway LR Clonase II enzyme Mix	Invitrogen	11791-100
Library efficiency competent cells DH5α	Invitrogen	12535-019
Library efficiency competent cells DB3.1	Invitrogen	11782-018
mMESSAGE mMACHINE Kit	Ambion	AM1340
HiSpeed Plasmid Midi Kit	Qiagen	12643
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-97
Pneumatic PicoPump	World Precision Instruments, Inc.	SYS-PV820