Summary
न्युट्रोफिल कोशिकी जाल (नेट) एक महत्वपूर्ण सहज प्रतिरक्षा तंत्र रोगजनक बैक्टीरिया, कवक और परजीवी से लड़ने रहे हैं. हम यहाँ के मानव रक्त से न्युट्रोफिल granulocytes अलग करने और उन्हें सक्रिय जाल फार्म विधियों का वर्णन. हम तैयारी तकनीक मौजूद प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में जाल कल्पना.
Abstract
न्युट्रोफिल granulocytes परिधीय रक्त में leukocytes के सबसे प्रचुर मात्रा में समूह रहे हैं. के रूप में पेशेवर phagocytes, वे निमग बैक्टीरिया और उन्हें intracellularly को मारने जब उनके phagosome साथ रोगाणुरोधी granules फ्यूज. हमने पाया है कि neutrophils सूक्ष्मजीवों की हत्या के एक अतिरिक्त तरीका है: सक्रियण पर, वे ग्रेन्युल प्रोटीन और chromatin है कि एक साथ कोशिकी फाइबर फार्म जारी है कि बाँध रोगज़नक़ों. ये उपन्यास संरचनाओं, या न्युट्रोफिल कोशिकी जाल (नेट), विषैलापन कारकों को नीचा दिखाना और एक बैक्टीरिया, 2 कवक और 3 परजीवी को मार. जाल के संरचनात्मक आधार डीएनए है, और वे जल्दी से DNases की उपस्थिति में अपमानित कर रहे हैं. इस प्रकार, DNases व्यक्त बैक्टीरिया अधिक 4 ज़हरीले हैं. Correlative माइक्रोस्कोपी मंदिर, SEM, immunofluorescence और जीने सेल इमेजिंग तकनीक के संयोजन का उपयोग करना, हम दिखा सकता है कि उत्तेजना पर, neutrophils के नाभिक उनके आकार खो देते हैं और homogenize - यूरोपीय संघ और heterochromatin. बाद में, परमाणु लिफाफा और ग्रेन्युल झिल्ली. NET घटक के मिश्रण की अनुमति बिखर. अंत में, नेट कोशिका झिल्ली टूट के रूप में जारी कर रहे हैं. यह कोशिका मृत्यु प्रोग्राम (NETosis) apoptosis और परिगलन से अलग है और NADPH oxidase 5 द्वारा प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की पीढ़ी पर निर्भर करता है है .
न्युट्रोफिल कोशिकी जाल तीव्र सूजन की साइटों पर प्रचुर मात्रा में हैं. जाल सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के एक रूप हो दिखाई देते हैं कि बाँध सूक्ष्मजीवों, उन्हें फैलने से रोकने के लिए, और antimicrobial एजेंटों के एक उच्च स्थानीय एकाग्रता विषैलापन कारकों नीचा और इस प्रकार रोगज़नक़ों को मारने neutrophils उनके जीवन काल से परे भी उनके antimicrobial समारोह को पूरा करने के लिए अनुमति देता है सुनिश्चित करने. वहाँ सबूत बढ़ रही है, तथापि, कि जाल भी रोगों कि में शामिल हैं ऑटो प्रतिरक्षा सिंड्रोम से 6 बांझपन के लिए सीमा होती है.
हम विधियों का वर्णन करने के लिए परिधीय मानव रक्त 7 से न्युट्रोफिल granulocytes को अलग करने और उन्हें प्रोत्साहित करने के लिए जाल फार्म . इसके अलावा, हम प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में जाल कल्पना प्रोटोकॉल शामिल हैं.
Protocol
1. मानव रक्त से PMN अलगाव
Anticoagulant के रूप में 24 मिलीलीटर EDTA या हेपरिन (10 यू / एमएल) के साथ मानव रक्त के बारे में प्रयोग करें.
- एक 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब 6 मिलीलीटर 1119 Histopaque जोड़ें और ध्यान से परत के शीर्ष पर 5 से 7 मिलीलीटर पूरे रक्त.
- 800 XG पर 20 मिनट के लिए ब्रेक लगाना के बिना अपकेंद्रित्र.
- Aspirate और पीले रंग के और स्पष्ट ऊपर परत त्यागें और कम लाल ताजा फाल्कन ट्यूबों में granulocytes युक्त चरण हस्तांतरण.
- X 300 जी में पीबीएस और 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र के साथ फाल्कन ट्यूबों भरने के द्वारा कोशिकाओं धो
- 2 मिलीलीटर 10x पीबीएस के साथ 18 मिलीलीटर Percoll मिश्रण से बीच में एक 100% Percoll समाधान तैयार. 1x पीबीएस के साथ 85%, 80%, 75%, 70% और 65% Percoll 4 मिलीलीटर समाधान तैयार है.
- एक Percoll ढाल के साथ layering घटते क्रम में एक दूसरे के शीर्ष पर हर प्रतिशत के 2 मिलीलीटर से 2 फाल्कन ट्यूबों तैयार करें.
- बाद centrifugation सतह पर तैरनेवाला हटायें, पीबीएस के 4 मिलीलीटर में छर्रों और resuspend sedimented कोशिकाओं गठबंधन.
- Gradients के प्रत्येक पर ध्यान से परत 2 resuspension के मिलीलीटर.
- 800 XG पर 20 मिनट के लिए ब्रेक लगाना के बिना अपकेंद्रित्र.
- बाद centrifugation ऊपर परत को हटाने और 65% परत के सबसे PBMCs के साथ और नए फाल्कन ट्यूबों में 85% परत जब तक सफेद शेष interphases इकट्ठा.
- X 300 जी में फाल्कन ट्यूबों भरने पीबीएस और 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र के साथ द्वारा कोशिकाओं को धो
- 2ml पीबीएस में सतह पर तैरनेवाला और resuspend sedimented कोशिकाओं (आमतौर पर> 95% PMN हैं) निकालें.
- एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं को गिन लो.
2. सक्रिय PMNs
- प्रत्येक अच्छी तरह से में एक बाँझ 13 मिमी दौर कांच कवर पर्ची (# 1,5) डाल द्वारा 24 अच्छी तरह से एक सेल संस्कृति की थाली तैयार
- 2 बीज x 10 500μl RPMI में 5 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से (2% मानव सीरम albumin युक्त) और 37 पर सीओ 2 इनक्यूबेटर में 1 के लिए सेते ° सी.
- इस बीच RPMI में 600 एनएम PMA समाधान तैयार करने और प्रति 100μl कोशिकाओं में अच्छी तरह से जोड़ें. 37 पर 15 सीओ 2 इनक्यूबेटर में 4 घंटे मिनट से सेते डिग्री सेल्सियस
- 4 (अंत एकाग्रता)% पीबीएस में भंग paraformaldehyde में कोशिकाओं को ठीक.
PMA एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है और अब तक सबसे शक्तिशाली एजेंट NET गठन प्रेरित है. वैकल्पिक रूप से, या अन्य रोगज़नक़ों के साथ सह खेती उत्तेजनाओं NET प्रेरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
NET गठन की संबंधित स्थिति है जबकि समय बेशक आगे बढ़ रहा है जाँच की जा सकती है, अगर अतिरिक्त समानांतर नमूने लिए तैयार हैं. यदि एक गैर permeant Sytox ग्रीन (Invitrogen) की तरह डीएनए डाई गैर तय कोशिकाओं को जोड़ा है, केवल कोशिकी डीएनए का पता लगाया जाएगा. नए जाल के गठन के बाद से किसी भी तरह Sytox की उपस्थिति में बिगड़ा हुआ है हर बार बिंदु के लिए एक समानांतर नमूना के लिए इस्तेमाल किया जा है.
3. NET का पता लगाने के द्वारा immunolabeling
जाल निर्धारण के बाद भी बहुत नाजुक रहे हैं और महान देखभाल के साथ चालाकी से किया जा अन्यथा बहुमत की तैयारी के दौरान खो जाएगा.
- ध्यान से इसे उठाने के किनारे पर एक घुमावदार सुई के साथ 24 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली से संलग्न कोशिकाओं के साथ कांच के कवर फिसल जाता है और यह ठीक एक संदंश के साथ हटायें जब्त. कवर पर्ची पीबीएस की एक बूंद पर उल्टा रखो. यह एक Parafilm पत्रक पर एक टेस्ट ट्यूब स्टैंड को कवर किया जा सकता है है. 5 मिनट के लिए इस 3 बार की तरह धो लें.
- Triton एक्स 100-आरटी पर 1 मिनट के लिए कोशिकाओं permeabilize 0.5% की एक बूंद में एक ही तरीके में कवर फिसल जाता है सेते हैं. पीबीएस में 1 मिनट के लिए 3 बार धोएं.
- Parafilm और एक गीले टिश्यू के साथ एक नम कक्ष तैयार है. लेटाओ कवर अवरुद्ध बफर (5% गधा सीरम) की एक बूंद पर उल्टा फिसल जाता है और 37 पर 30 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस
- बफर अवरुद्ध में प्राथमिक एंटीबॉडी, जैसे एमएस विरोधी Histon और आरबी विरोधी न्युट्रोफिल इलास्टेज, पतला.
- उमस भरे कक्ष में निकल जाता है सीधे और प्राथमिक एंटीबॉडी की एक बूंद पर बफर अवरुद्ध से कवर पर 37 घंटे एक के लिए सेते स्थानांतरण डिग्री सेल्सियस
- पीबीएस के साथ 5 मिनट के लिए 3 बार धोएं.
- माध्यमिक एंटीबॉडी, जैसे dk विरोधी एमएस Cy2 और dk विरोधी Cy3 बफर को रोकने में, आरबी पतला.
- नम चैम्बर में चले जाते हैं और माध्यमिक एंटीबॉडी की एक बूंद पर कवर पर 37 घंटे एक के लिए सेते स्थानांतरण डिग्री सेल्सियस
- पीबीएस के साथ 5 मिनट के लिए 3 बार धोएं. अपने प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी विकल्पों पर निर्भर करता है, दाग डीएनए 33342 Hoechst (1 μg / एमएल) जो यूवी या Draq5 तक लाल उत्तेजना के लिए एक साथ उत्तेजना की जरूरत है और जिले के साथ दो बार धोने के साथ 5 मिनट के लिए या तो. पानी.
- एक गिलास स्लाइड पर एक Mowiol के 20μl ड्रॉप सेट और कोशिकाओं के साथ कवर फिसल जाता है उल्टा माउंट. कोशिकाओं को कवर पर्ची और स्लाइड के बीच होना है. ड्रॉप Mowiol के समरूप मोटाई जब कवर पर्ची ड्रॉप पर तैनात है की एक पतली परत के रूप में होगा. आम तौर पर, वहाँ कोई नमूना प्रेस की जरूरत है. यदि आप गैर - विसर्जन लेंस का उपयोग करना चाहते हैं हैं, नमूना निरीक्षण के लिए तैयार है.विसर्जन लेंस के साथ सूक्ष्म विश्लेषण के लिए, नमूना के बारे में 1 घंटे के लिए सूखी जब तक Mowiol नमूने के किनारे पर जम गया है चलो.
4. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग के लिए तैयारी नेट (SEM)
- पोस्ट 2,5% glutaraldehyde के साथ कांच के 24 अच्छी तरह से थाली में कवर फिसल जाता है पर कोशिकाओं को ठीक.
- गिलास को कवर फिसल जाता है 24 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली से कोशिकाओं से युक्त निकालें और पानी की एक बूंद पर उल्टा डाल दिया. 5 मिनट के लिए इस 3 बार की तरह धो लें.
- 24 अच्छी तरह से सेल संस्कृति 30 मिनट के लिए 0,5 OsO4% और सेते युक्त थाली में कवर फिसल जाता है वापस स्थानांतरण.
- गिलास को कवर फिसल जाता है 24 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली से कोशिकाओं से युक्त निकालें और पानी की एक बूंद पर उल्टा डाल दिया. 5 मिनट के लिए इस 3 बार की तरह धो लें.
- 24 अच्छी तरह से सेल संस्कृति 30 मिनट के लिए 1% tannic एसिड और सेते युक्त थाली में कवर फिसल जाता है वापस स्थानांतरण.
- चरणों को दोहराएँ 4,2 करने के लिए 4,4
- निम्नलिखित आहार के माध्यम से निर्जलीकरण (5min प्रत्येक):
- 30% इथेनॉल
- 50% इथेनॉल
- 70% इथेनॉल
- 80% इथेनॉल
- 90% इथेनॉल
- 100% इथेनॉल
- 100% इथेनॉल
- 100% इथेनॉल
- महत्वपूर्ण बिंदु ड्रायर और सूखी नमूने में निकल जाता है कवर स्थानांतरण.
- नमूना के 5nm / platin कार्बन पतली परत बाष्पीकरण का उपयोग परत के साथ कोट सतह
5. प्रतिनिधि परिणाम:
अलगाव की विधि आम तौर पर एक 95% से अधिक शुद्धता के साथ व्यवहार्य neutrophils unstimulated पैदावार. जब उत्तेजना के बाद अलग अलग समय बिंदुओं पर तय, immunostaining प्रोटोकॉल NETosis सपाट सेल, परमाणु lobules की हानि, ग्रेन्युल का नुकसान नाभिक और अखंडता है जो परमाणु (यानी histone) और दानेदार (यानी की एक बढ़ती हुई ओवरलैप करने के लिए सुराग के दौरान morphological परिवर्तन के अनुक्रम से पता चलता है न्युट्रोफिल इलास्टेज) धुंधला हो जाना. इस प्रोटोकॉल neutrophils साथ रोगजनकों के विशिष्ट बातचीत का विश्लेषण एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में सेवा कर सकते हैं. यह अधिक से अधिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग के लिए तैयार प्रोटोकॉल का उपयोग कर विस्तार से बातचीत में dissected किया जा सकता है है.
NET प्रतिदीप्ति
उत्तेजित NET घटक (नीला = डीएनए, लाल = histone, हरे = न्युट्रोफिल इलास्टेज) के लिए दाग neutrophils का नमूना. छवियों NET स्थानीयकरण, डीएनए और histones के परमाणु स्थानीयकरण और न्युट्रोफिल इलास्टेज के लिए दानेदार पैटर्न के अलावा दिखाने के लिए,.
SEM PMA उत्तेजना
गैर उत्तेजित और PMA उत्तेजित neutrophils दिखा इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ स्कैनिंग. उत्तेजना के बाद, neutrophils बाहर समतल और नेट का उत्पादन.
SEM जाल और शिगेला
जाल में फंस शिगेला बैक्टीरिया के उच्च संकल्प SEM छवि.
Discussion
प्रदान प्रोटोकॉल काफी शुद्धता पर गैर उत्तेजित neutrophils के अलगाव NET गठन की प्रेरण और NETosis दौरान morphological परिवर्तन का विश्लेषण की अनुमति देगा. जब देखभाल के साथ नमूनों से निपटने, यानी कठोर धोने की स्थिति है जो शिथिल संलग्न जाल के अधिकांश के नुकसान में परिणाम देगा से बचने विभिन्न उत्तेजना शर्तों के अधीन. NET गठन (अवधि, उत्तेजना) की राशि की तुलना में किया जा सकता है. न्युट्रोफिल / रोगज़नक़ बातचीत, उत्तेजनाओं के अनुक्रम, अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ परस्पर क्रिया: इस संबंध में, एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में करने के तरीकों को स्थापित करने के लिए और अधिक परिष्कृत परिदृश्यों का विश्लेषण प्रदान प्रोटोकॉल सेवा कर सकते हैं.
References
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