Tessuti vegetali, tra cui floema e xilema di pino loblolly ( Pinus taeda L.), contengono alti livelli di fenoli e polisaccaridi che interferiscono con la purificazione di RNA. Questa presentazione discute le tecniche per la raccolta del campo coltivato tessuti e l'isolamento di RNA di qualità sufficiente per microarray e analisi genomiche di altri.
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Articolo metodologico
Un metodo migliorato di isolamento dell'RNA da Pino Loblolly ( P. taeda L.) e altre specie di conifere
In questo articolo
Sommario
Abstract
Tessuti isolati da specie di conifere, in particolare quelli appartenenti alla famiglia delle Pinaceae, come il pino loblolly (
Protocollo
Parte 1: Harvest Albero
Dopo che l'albero viene selezionato e abbattuto, è importante lavorare con la stessa cura e il più rapidamente possibile. Come ogni tipo di tessuto diverso è raccolto, che dovrebbe essere messo immediatamente in loro pescherecci azoto liquido per evitare qualsiasi contaminazione del materiale del campione. Questo protocollo di isolamento del RNA è scalabile.
- Tagliare i bulloni in lunghezze di circa 0,5-0,75 metri e con un punteggio motosega la corteccia in due o tre posti dopo l'asse longitudinale del bullone.
- Utilizzando uno scalpello in legno, opera ai margini della regione ha segnat....
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Discussione
Ottenere di alta qualità RNA da specie di conifere può essere un compito difficile, visti gli elevati livelli di composti fenolici e polisaccaride che si trova nei tessuti legnosi. A partire dal protocollo sviluppato da Chang et al. (1), abbiamo trovato che l'estrazione più rigorosa e ripulire gradini conducono all'isolamento coerente di altissima qualità RNA totale da woody diversi e non-tessuti legnosi campionato da una grande varietà di specie di conifere. Questo video ha dimostrato non solo il nostro protoco.......
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Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare le seguenti persone senza il cui aiuto la collezione di tessuti pino non sarebbe stato possibile: Dr. Joe Nairn, Matt Bryman, Michael Bordeaux, Ujwal Bagal, Huizhe Jin, e Amanda Bouffier.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Buffer per l'isolamento dell'RNA | 2% CTAB (bromuro di esadeciltrimetilammonio), 2% PVP (polivinilpirrolidone; Mw 30-40.000), 100 mM Tris-HCl (pH 8,0), 25 mM EDTA, 2,0 M NaCl, 0,5 g/L spermidina | ||
| Cloroformio | Fisher Scientific | C298-4 | |
| Fenolo, Ultrapuro | Invitrogen | 15509-037 | |
| LiCl 10 M | Preparato con acqua trattata con DEPC | ||
| Buffer SSTE | 1 M NaCl, 0,5% SDS, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0) | ||
| Acetato di sodio (NaOAc) 3 M pH 4,8 | Preparato con acqua trattata con DEPC | ||
| Fenolo-cloroformio (pH 8,0) | 120 mL fenolo, 160 mL cloroformio titolati con più passaggi di Tris-Cl 0,5 M pH 8,0 | ||
| Tubi in teflon per centrifuga ad alta velocità Oak Ridge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #05-562-16B | |
| Tubi in polipropilene da 50 mL per centrifuga ad alta velocità | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #05-562-10K | |
| Tubi conici sterili da 50 mL con tappo, monouso BD Falcon | VWR international | #21008-939 | |
| Phase Lock Gel Heavy, 2 mL | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #2302830 | |
| Tubi microcentrifuga Ambion privi di RNasi, 2 mL | Ambion | #AM12425 |
Riferimenti
- Chang, S., Puryear, J., Cairney, J. A simple and efficient method for extracting RNA from pine trees. Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 113-116 (1993).
- Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Siműes, M., Dean, J. F. D. Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microar....
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Ristampe e permessi
