Deze video toont een methode te ontleden en cultuur commissural neuronen van de E13 rat dorsale ruggenmerg. Gedissocieerd commissural neuronen zijn nuttig om de cellulaire en moleculaire mechanismen van axon groei en begeleiding te bestuderen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Dissectie en Cultuur van Commissural neuronen van het ruggenmerg Embryonic
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Commissural neuronen zijn op grote schaal gebruikt om de mechanismen die ten grondslag liggen aan axon begeleiding tijdens de embryonale ontwikkeling van het ruggenmerg te onderzoeken. De cellichamen van deze neuronen bevinden zich in het dorsale ruggenmerg en hun axonen volgen stereotiepe trajecten tijdens de embryonale ontwikkeling. Commissural axonen in eerste instantie ventraal project de richting van de vloerplaat. Na het oversteken van de middellijn, deze axonen naar voren en het project richting de hersenen. Elk van deze stappen wordt gereguleerd door de werking van verschillende begeleiding cues. Culturen sterk verrijkt in commissural neuronen zijn bij uitstek geschikt voor vele experimenten het aanpakken van de mechanismen van axon pathfinding, waaronder het draaien assays, immunochemie en biochemie. Hier beschrijven we een methode te ontleden en cultuur commissural neuronen van de E13 rat dorsale ruggenmerg. Eerst wordt het ruggenmerg geïsoleerd en dorsale strips ontleed uit. De dorsale weefsel wordt dan gedissocieerd in een cel schorsing door behandeling met trypsine en mechanische storingen. Neuronen zijn uitgeplaat op poly-L-lysine-gecoat glas dekglaasjes of weefselkweek gerechten. Na 30 uur
Protocol
1. Dissectie van embryonale rat dorsale ruggenmerg
Algemene aanbevelingen
Houd L-15-medium op het ijs en vaak het medium verandering in de dissectie schotel om de embryo's af te koelen. Dit spaart weefsel integriteit. Alle stappen worden uitgevoerd met twee paar van Dumont # 5 tang tenzij anders vermeld. Om contaminatie te voorkomen, spray alle gereedschappen en werkoppervlakken met 70% ethanol en houden dissectie medium fles gesloten. Voor de overdracht van embryo's tussen de gerechten, gebruik dan een cut plastic pipet of een geperforeerde lepel. Het is van levensbelang, niet aan het ruggenmerg (knikken, stretchi....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
We hebben beschreven een methode te ontleden en cultuur commissural neuronen uit embryonale rat ruggenmerg. Deze procedure is routinematig gebruikt in ons lab om op betrouwbare wijze voor te bereiden neuronen om de cellulaire en moleculaire mechanismen van axon begeleiding te bestuderen. Voor celbiologie en immunochemie experimenten, dissectie van een nest produceert voldoende neuronen. Wanneer er meer cellen nodig zijn, kunnen dergelijke zoals in veel biochemie experimenten, dissectie van twee nestjes nodig zijn. Voor .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Canadese Institutes of Health Research (CIHR), de Peter Lougheed Medical Research Foundation, de McGill Program in Neuroengineering, het Fonds de Recherche en Sante du Quebec (FRSQ), en de Canada Foundation voor Innovatie (CFI ). Sebastien D. Langlois werd ondersteund door een opleiding Master's Award van het Fonds de la Recherche en sante du Quebec (FRSQ) en door een Frederick Banting en Charles Best Graduate Canada Beurzen Master Award van de Canadese Institutes of Health Research (CIHR). Wij zijn dankbaar voor Jessica MT Pham voor hulp met cijfers.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
Dissectie van embryonale rat dorsale ruggenmerg (zie ook tabel I)
- E13 zwangerschap geënsceneerd rat
- Ethanol 70%
- Chirurgische schaar, Fine Science Tools
- Tang, Dumont # 5, Fine Science Tools
- Petrischalen
- L-15-medium
- Dissection microscoop, Leica
- Plastic overdracht pipetten
- Microscissors, Fine Science Tools
- Tungsten naalden en pin houders van (een haakvormige naald, een L-vormen naald, een rechte naald), Fine Science Tools
- Hitte-geïnactiveerd Horse Serum (HiHS)
- 15 ml plastic buizen
Commissural neuron cultuur (zie ook tabel I)
- Weefselkweek incubatoren (37 ° C, 5% CO 2, vochtigheid)
- Duitse Desag dekglaasjes en / of kunststof weefselkweek gerechten
- Poly-L-lysine, Sigma
- Steriele milliQ H 2 O
- Neurobasal, Invitrogen
- Hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum (HiFBS)
- L-Glutamine
- B27, Invitrogen
- Penicilline / streptomycine antibiotica
- 37 ° C waterbad
- Steriel Pasteur Pipetten
- Bunsen gasbrander
- HBSS, Ca 2 + / Mg 2 +-vrij, Invitrogen
- DNAse, Worthington
- MgSO 4
- Centrifuge
- Hemacytometer
- Trypan blauwe oplossing
Referenties
- Charron, F., Stein, E., Jeong, J., McMahon, A. P., Tessier-Lavigne, M. The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance. Cell. , 113-1111 (2003).
- Fabre, P., Shimogori, T., Charron, F.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
